Ghrelin對多柔比星誘導大鼠心力衰竭和心肌損傷的保護作用及機制

趙蔭濤 裴小鑫 胡鉑 楊海波 董建增 劉源

1鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科（鄭州450052）；2同濟大學附屬東方醫(yī)院心血管內(nèi)科（上海200120）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種原發(fā)性和繼發(fā)性心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同表現(xiàn)［1］。慢性心衰不僅嚴重危害人類的健康，而且給患者家庭和社會帶來沉重經(jīng)濟負擔［2］。隨著我國經(jīng)濟水平、環(huán)境和醫(yī)療衛(wèi)生健康方面的發(fā)展，人口預期壽命明顯延長，罹患惡性腫瘤患者數(shù)量也隨著增加［3］。部分抗腫瘤藥物具有誘發(fā)心肌炎癥反應、損傷心臟功能以及誘導心衰的不良作用，導致腫瘤患者承受治療能力下降，嚴重影響抗腫瘤治療的效果［4］。因此，尋找能減輕心肌炎癥、改善心臟功能來對抗抗腫瘤藥物治療所引起的心臟毒性的因素或藥物，對提高腫瘤患者的治療效果有重要的臨床意義。

多柔比星（doxorubicin，DOX）是一種蒽醌類抗腫瘤藥物，臨床上廣泛應用于多種抗腫瘤治療。但是，多柔比星會引起劑量依賴性的心臟毒性，可以導致不可逆的心肌損傷以及充血性心力衰竭［5］。多柔比星的心臟毒性嚴重干擾了它的臨床應用。Ghrelin 是1999年在尋找生長激素促分泌素受體（GHS-R）的內(nèi)源性配體時被發(fā)現(xiàn)的一種促進生長激素釋放的多肽［6］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin 具有廣泛的生理學作用并與多種病理生理過程密切相關，如肥胖、心血管疾病和糖尿病等慢性疾?。?］。但是，Ghrelin 是否對多柔比星引起的大鼠心肌損傷和心衰有保護作用以及有關機理還沒有報道。本試驗通過研究Ghrelin作用于多柔比星誘發(fā)大鼠心肌損傷及心衰來探討Ghrelin 在藥物性心肌病中的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料健康成年10 周齡雄性Sprague Dawley（SD）大鼠［動物許可證號：SYXK（滬）2003-0026］32 只，體質(zhì)量250 ～300 g，購于上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部。分籠喂養(yǎng)，4 只大鼠一籠。飼料為大鼠用普通飼料配方，動物房室內(nèi)溫度控制在24 ℃左右，12 h 明暗循環(huán)條件下喂養(yǎng)。

1.2 試劑與設備動物心臟超聲檢測機器和心臟超聲探頭（Visual Sonics，加拿大），鹽酸多柔比星購于輝瑞制藥（無錫）有限公司，鹽酸氯胺酮液購于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，CM1900 冰凍切片機（Leica，德國），酶標儀器（Thermo，芬蘭），大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α 和大鼠白介素（IL）-10 酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）試劑盒購于美國Sigma 公司，大鼠15-F2t-isoprostane 試劑盒購于美國Cell Biolabs 公司，大鼠Ghrelin 購于美國Anaspec 公司。

1.3 動物分組和模型制備32 只大鼠隨機分成3 組。心力衰竭組（n= 13）和Ghrelin 組（n= 13）給予大鼠腹腔注射多柔比星溶液2 mg/kg 建立大鼠心力衰竭動物模型。對照組（n= 6）大鼠相同方法注射等容積的9 %氯化鈉注射液。試驗過程中定期觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動量、體質(zhì)量等大體情況，觀察時間為8 周。

1.4 動物模型評估大鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮全身麻醉，對照組大鼠劑量為100 mg/kg，心力衰竭組和Ghrelin 組大鼠劑量為70 mg/kg。麻醉后用8% Na2S 脫毛，固定動物工作臺上行超聲心動圖檢查。測量參數(shù)包括：左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVSD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS），在3 個心動周期內(nèi)完成測定并保存數(shù)據(jù)。所有實驗數(shù)據(jù)由同一個研究員來完成，保證研究結果的統(tǒng)一性。

1.5 超聲心動圖檢測造模后，Ghrelin 組給予50 nmol/kg Ghrelin，心力衰竭組和對照組分別給予等容積生理鹽水，共持續(xù)6 周，均分別于每天上午8：00 和下午4：30 采用腹腔內(nèi)注射方式給藥。干預結束后再次對Ghrelin 組、心力衰竭組和對照組大鼠進行超聲心動圖檢查。

1.6 血流動力學測定采用MPA-V 多道生物信號分析系統(tǒng)進行檢測。鹽酸氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定，常規(guī)8% Na2S 脫去大鼠頸部皮毛，消毒，取頸部正中切口暴露兩側頸總動脈，分離出右頸總動脈，結扎遠心端，并暫時夾閉近心端，逆行插入充滿肝素生理鹽水的聚苯乙烯導管至左心室。觀察壓力容積曲線，并記錄以下血流動力學指標，包括：左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張壓（LVDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dP/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dP/dtmax）。

1.7 心肌HE 染色采用斷頭法處死大鼠，取出心肌組織先經(jīng)液氮處理，放置-80 ℃冷凍后制備冰凍組織切片，常規(guī)HE 染色，在光學顯微鏡下觀察心肌組織學變化。

1.8 血漿炎癥因子和15-F2t-isoprostane水平處死大鼠時取血4 mL，于4 ℃下1 500 r/min 離心10 min，去上清液，分裝凍存于-80 ℃冰箱。采用ELISA 法檢測血漿TNF-α、IL-10 和15-F2t-isoprostane 水平。

1.9 統(tǒng)計學方法應用SPSS 15.0 軟件包進行統(tǒng)計分析。各參數(shù)以（x±s）表示，多組間采用單因素方差分析（方差齊）、兩組間比較采用SNK-q檢驗；或多組間采用Kruskal-Wallis 檢驗（方差不齊），兩組間采用Wilcoxon 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 多柔比星造模后大鼠超聲心動圖變化所有大鼠在造模期間均存活，多柔比星造模8 周后予Ghrelin 干預前行超聲心動圖檢查。相比對照組，心力衰竭組大鼠左心室顯著擴大，室壁活動明顯減弱，LVDD 和LVSD 明顯增加（P＜0.01），LVEF 和LVFS 明顯降低（P＜0.01），表明心力衰竭建立。見表1。

2.2 Ghrelin 干預后大鼠超聲心動圖變化Ghrelin干預后，與心力衰竭組比較，Ghrelin 組LVSD 明顯減少（P＜0.05），LVEF明顯增加（P＜0.05），表明Ghrelin明顯改善心衰大鼠的心臟功能。見圖1、表2。

表1 對照組與心力衰竭大鼠心臟超聲心動圖參數(shù)比較Tab.1 Comparision of echocardiographic parameters in control group and HF group ± s

表1 對照組與心力衰竭大鼠心臟超聲心動圖參數(shù)比較Tab.1 Comparision of echocardiographic parameters in control group and HF group ± s

注：LVDD，左心室舒張末期內(nèi)徑；LVSD，左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEF，左心室射血分數(shù)；LVFS，左心室縮短率；與對照組比較，*P ＜0.01

組別對照組心力衰竭組例數(shù)6 26 LVDD（mm）5.14 ± 0.53 6.68 ± 0.67*LVSD（mm）1.21 ± 0.22 2.85 ± 0.27*LVEF（%）95.79 ± 9.35 79.04 ± 9.08*LVFS（%）78.26 ± 8.82 55.31 ± 7.84*

圖1 各組大鼠心臟超聲圖像Fig.1 Echocardiogram in different group

表2 各組大鼠心臟超聲心動圖參數(shù)比較Tab.2 Comparisin of echocardiographic parameters in different group ± s

表2 各組大鼠心臟超聲心動圖參數(shù)比較Tab.2 Comparisin of echocardiographic parameters in different group ± s

注：LVDD，左心室舒張末期內(nèi)徑；LVSD，左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEF，左心室射血分數(shù)；LVFS，左室縮短率；與心力衰竭組比較，*P ＜0.05；與對照組比較，#P ＜0.01

組別對照組心力衰竭組Ghrelin 組例數(shù)6 13 13 LVDD（mm）5.10 ± 0.74 6.98 ± 0.68#6.75 ± 0.65#LVSD（mm）1.31 ± 0.23 3.56 ± 0.36#3.24 ± 0.39*#LVEF（%）96.05 ± 9.87 75.70 ± 8.45#83.02 ± 8.98*#LVFS（%）78.65 ± 8.32 50.43 ± 5.25#53.51 ± 7.34#

2.3 血流動力學檢測與對照組大鼠比，心力衰竭組 大 鼠 的LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmax 顯著 降低（均P＜0.05），LVDP 升高（P＜0.01）。與心力衰竭組比較，Ghrelin 組大鼠的+dP/dtmax 顯著增加（P＜0.01），表明Ghrelin 明顯改善心衰大鼠的血流動力狀況。見表3。

表3 各組大鼠心臟血流動力學參數(shù)比較Tab.3 Comparisin of cardiac hemodynamics in different group ± s

表3 各組大鼠心臟血流動力學參數(shù)比較Tab.3 Comparisin of cardiac hemodynamics in different group ± s

注：LVSP，左心室收縮壓；LVED，左心室舒張壓；+dP/dtmax，左心室內(nèi)壓最大上升速率；-dP/dtmax，左心室內(nèi)壓最大下降速率；與心力衰竭組比較，*P ＜0.01；與對照組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別對照組心力衰竭組Ghrelin 組例數(shù)6 13 13 LVSP（mmHg）112.71 ± 13.36 95.09 ± 14.95#98.70 ± 13.13#LVEP（mmHg）5.77 ± 1.62 10.26 ± 2.54△9.61 ± 2.13△+dP/dtmax（mmHg/s）6 334.76 ± 345.34 4 013.45 ± 282.17△5 236.58 ± 315.73*△-dP/dtmax（mmHg/s）5 116.45 ± 245.61 2 938.77 ± 202.17△3 071.46 ± 158.45#

2.4 心肌形態(tài)組織學變化對照組光鏡下為心肌細胞排列整齊，細胞核清晰，橫紋清晰，細胞間隙正常，無細胞變性和壞死，組織間質(zhì)無炎癥性滲出（圖2）。心力衰竭組心肌細胞失去正常形態(tài)結構，心肌細胞排列不規(guī)則，部分出現(xiàn)變性、溶解、壞死，心肌細胞間隙增寬，間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)炎癥細胞浸潤。Ghrelin 組可見心肌細胞變性和壞死的程度和范圍較心力衰竭組明顯減輕。

2.5 血漿炎癥因子和15-F2t-isoprostan 水平與對照組比較，心力衰竭組大鼠的血漿TNF-α、IL-10 和15-F2t-isoprostane 水平明顯升高（P＜0.01）。Ghrelin組較心力衰竭組大鼠的血漿TNF-α 和15-F2t-isoprostane 水平明顯降低（P＜0.01），血漿IL-10 水平明顯升高（P＜0.05），表明Ghrelin 明顯改善心衰大鼠體內(nèi)的炎癥反應。見表4。

圖2 光鏡下大鼠心肌組織HE 染色圖片（× 400）Fig.2 HE staining image of myocardium under light microscope（× 400）

表4 各組血漿TNF-α、IL-10 和15-F2t-isoprostane 水平變化Tab.4 Comparisin of plasma TNF-α，IL-10 and 15-F2tisoprostane level in different group ± s

表4 各組血漿TNF-α、IL-10 和15-F2t-isoprostane 水平變化Tab.4 Comparisin of plasma TNF-α，IL-10 and 15-F2tisoprostane level in different group ± s

注：TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-10，白介素-10；與心力衰竭組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01；與對照組比較，△P ＜0.01

組別對照組心力衰竭組Ghrelin組例數(shù)6 13 13 TNF-α（pg/mL）13.65±3.04 54.56±12.18△39.91±10.07#△IL-10（pg/mL）78.82±8.73 111.25±23.48△137.03±26.42*△15-F2t-isoprostane（pg/mL）78.89±12.02 155.21±16.15△104.61±13.96#△

3 討論

多柔比星是一種蒽醌類抗腫瘤化療藥物，臨床用于各種實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的治療，但是由于心臟的嚴重毒性作用使其在臨床上應用受到一定的限制［8］。多柔比星誘導的心肌病病理特征多與擴張型心肌病相似，包括：心肌細胞凋亡、線粒體腫脹、心肌細胞能量代謝紊亂和氧自由基（ROS）聚集［9］。但是，研究發(fā)現(xiàn)抑制ROS 聚集不能改善多柔比星對心臟的毒性作用［10］，因此推測要從多種因素、多種路徑干預才可能有明顯效果。本研究表明Ghrelin 對多柔比星引起的大鼠心肌損傷有一定的保護作用，能夠改善心臟的收縮功能，并且在組織學上一定程度上抑制心肌細胞的壞死以及調(diào)節(jié)循環(huán)中炎癥因子和15-F2t-isoprostane表達。

Ghrelin 合成和分泌主要來自消化道，但是其受體在身體的各個組織器官中都有表達。Ghrelin在機體攝食和能量平衡調(diào)節(jié)中起到關鍵作用。另外，Ghrelin 可以作用于健康和罹患心臟病的個體心肌組織。有研究［11］表明CHF 患者血漿Ghrelin 水平明顯高于健康人群，而心臟移植后血漿Ghrelin水平回落。同時，Ghrelin 可以通過促進垂體釋放生長激素以及直接刺激GHS-R 以改善CHF 患者的心臟功能和心輸出量［12］。在一項健康成人研究［13］中證實，給予雙倍人體生理劑量的Ghrelin 后可以明顯提高心臟指數(shù)（CI）和心臟搏出量指數(shù)（SVI）同時伴隨降低外周血管阻力。以前的動物模型研究也發(fā)現(xiàn)，擴張型心肌病大鼠給予外源性Ghrelin能夠降低左室舒張末期容積和提高LVEF，并且可以提高大鼠30 d 生存率［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)Ghrelin可以部分改善心衰大鼠的心臟血流動力學參數(shù)。另一方面，Ghrelin 可以抑制健康人群交感神經(jīng)活性，同時激活副交感神經(jīng)活性，這可能部分解釋為什么Ghrelin可以提高擴張型心肌病大鼠生存率［15］。本研究也證實，藥物毒性心肌病大鼠給予外源性Ghrelin 在組織學上改善心肌細胞損傷，減小LVSD以及提高LVEF 和LVFS。

CHF 是一種慢性炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)在血漿中炎癥因子TNF-α 水平升高和腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活［16］。Ghrelin 能夠抑制血管內(nèi)皮細胞過多產(chǎn)生氧化應激產(chǎn)物和NADPH 氧化酶激活，同時也通過抑制腫瘤壞死因子-κB（NF-κB）活化以抑制前炎癥細胞因子生成。在一項對心肺移植患者的研究［17］中發(fā)現(xiàn)Ghrelin 可以降低循環(huán)中TNF-α、IL-6 水平和髓過氧化物酶活化達到保護心臟的作用。IL-10作為一種抗炎性細胞因子，能夠抑制充血心力衰竭過程中產(chǎn)生的炎性細胞因子，可直接對抗心肌由炎性細胞因子介導的損害，對心臟有保護作用［18］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin 可以提高IL-10 表達，提示Ghrelin 可能通過IL-10 在改善心力衰竭大鼠心功能中起到一定的作用。15-F2t-isoprostane 屬于異構前列腺素家族成員，被認為是反映機體氧化應激、脂質(zhì)過氧化損傷強度理想的生化指標。本研究在多柔比星誘導的心力衰竭大鼠模型中發(fā)現(xiàn)大鼠血漿15-F2t-isoprostane含量明顯升高，給予Ghrelin干預后血漿15-F2t-isoprostane 水平顯著下降，說明Ghrelin 可能部分通過抑制機體氧化應激反映，維持氧化/抗氧化平衡達到保護心臟的作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin 可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子途徑，促使肝臟細胞外基質(zhì)（ECM）降解，來抑制缺血再灌注誘導的肝纖維化發(fā)生發(fā)展，推測Ghrelin 可能對心臟或許有相似的有益作用，有待下一步研究證實［19］。既往研究［20］認為Ghrelin 能通過影響AMPK 和p38-MAPK 信號通路減輕多柔比星引起的小鼠的心臟毒性。因此，本研究認為Ghrelin 通過多種不同機制對多柔比星引起的心肌損傷和心衰起到保護作用的。

本研究具有一定的局限性。比如，對分子機制方面的探討不夠深入。在將來的研究中，可以對Ghrelin 組和心力衰竭組的心臟進行單細胞測序，更深入的理解不同的心臟細胞對Ghrelin 治療的反應。

綜上，Ghrelin 可以保護多柔比星對大鼠的心肌組織的損傷和改善心臟功能。這一發(fā)現(xiàn)為研究來源于消化道的生物活性物質(zhì)Ghrelin 在預防和治療藥物毒性引起的心肌病類疾患的有益作用提供了一種新思路。在將來，可以研究Ghrelin 是否和其他有預防和治療藥物毒性引起的心肌病療效的藥物具有協(xié)同效應，以減少在臨床應用時毒副作用的發(fā)生，同時進一步增強預防和治療效應。