去泛素化酶抑制劑Au（PPh3）PT對(duì)胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響及機(jī)制

張培全 黃擎天 龍惠丹 李小芬

廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省蛋白質(zhì)修飾與降解重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州511436）

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別為全球惡性腫瘤的第五位和第三位［1］。在我國(guó)胃癌患者總體5年生存率不足50%［2］，化療作為晚期胃癌最常用的治療手段之一［3-4］，發(fā)揮了重要作用，但存在許多不良反應(yīng)［5-7］，迫切需要開(kāi)發(fā)其他抗胃癌藥物。Au（PPh3）PT 為實(shí)驗(yàn)室研發(fā)合成的一價(jià)金離子化合物，已被證實(shí)可以有效抑制多種去泛素化酶（deubiquitinase，DUB），是一種潛在的抗腫瘤藥物［8］。本研究旨在探索Au（PPh3）PT 能否有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的毒性作用，為胃癌的治療提供新的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃癌細(xì)胞系MGC-803 和SGC-7901 由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所惠贈(zèng)，均來(lái)源ATCC 細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；MTS 試劑盒購(gòu)自Promega；抗caspase-3、抗caspase-8、抗caspase-9、抗cleaved caspase-8 及抗PARP 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗K48-、抗GAPDH、抗cleaved caspase-3 和抗cleaved caspase-9 抗體購(gòu)于Bioworld Technology；Annexin V - fluoroisothiocyanate （FITC）/propidium iodide（PI）試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ECL 發(fā)光試劑盒、抗Ub 抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/抗鼠IgG 購(gòu)自Santa Cruz；其他生化試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器Varioskan Flash 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；熒光倒置顯微鏡（德國(guó)ZEISS 公司）；HERA cell 150i 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；Accuri C6 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD FACSAria 公司）；5810R 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.4.2 MTS 法測(cè)定細(xì)胞活力收集細(xì)胞，調(diào)為1 ×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，每孔100 μL，接種到96 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)24 h；棄掉舊培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液（含1%的Au（PPh3）PT 藥物溶液）100 μL，設(shè)DMSO 溶劑對(duì)照及空白對(duì)照組，分別作用24、48、72 h，加入20 μL MTS，避光培養(yǎng)2 ～4 h 后檢測(cè)OD值，計(jì)算抑制率及IC50。

1.4.3 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡將胃癌細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，制成2 × 105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種到6 孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h；棄掉舊培養(yǎng)基，加入3 mL 含藥物的新培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；PBS 洗滌后每孔加入500 μL 的Binding Buffer，再依次加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染色液，混勻，室溫避光孵育15 min，倒置熒光顯微鏡拍照，記錄細(xì)胞形態(tài)及熒光標(biāo)記情況。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞鋪板、加藥，培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，用不含EDTA的胰蛋白酶溶液消化，PBS 洗滌，收集細(xì)胞；每管加入500 μL 的Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染色液，混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4.5 Western blot 檢測(cè)蛋白水平細(xì)胞經(jīng)消化、離心、PBS 洗滌后收集，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎儀破碎細(xì)胞。4 ℃，13 000 r/min，離心10 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將濃度調(diào)一致。SDS電泳法檢測(cè)蛋白水平，10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；轉(zhuǎn)膜，4 ℃冰浴，286 mA 恒電流150 min；將PVDF 膜完全浸入5%脫脂牛奶中，37 ℃平緩搖動(dòng)1 h；封閉結(jié)束后加入一抗室溫下孵育1 h；TBS/T漂洗后，將PVDF 膜浸入含8 mL 二抗的脫脂牛奶中，37 ℃搖動(dòng)1 h；再用TBST 進(jìn)行充分漂洗，最后采用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行膠片曝光檢測(cè)相關(guān)蛋白的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行3 次，GraphPad Prism 5.0 和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Au（PPh3）PT 對(duì)胃癌細(xì)胞活力的抑制情況Au（PPh3）PT 作用24、48、72 h 后，MTS 方法檢測(cè)Au（PPh3）PT 對(duì)胃癌細(xì)胞活力的抑制情況，可見(jiàn)Au（PPh3）PT 明顯抑制胃癌細(xì)胞的活力，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

圖1 Au（PPh3）PT 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞活力的抑制Fig.1 Au（PPh3）PT inhibited the cell viability in gastric cancer cell lines

2.2 Au（PPh3）PT 引起胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著Au（PPh3）PT 濃度的增高，Annexin VFITC/PI 雙染的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，并伴有典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，表明Au（PPh3）PT 可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖2。

圖2 Au（PPh3）PT 導(dǎo)致胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化Fig.2 Au（PPh3）PT induced morphological changes in gastric cancer cell lines

2.3 Au（PPh3）PT 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的情況為進(jìn)一步確證Au（PPh3）PT 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果表明隨著Au（PPh3）PT 濃度的增高，細(xì)胞凋亡率增高，與溶劑對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Au（PPh3）PT 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡Fig.3 Induction of apoptosis in gastric cancer cell lines by Au（PPh3）PT

2.4 Au（PPh3）PT 引起胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化免疫印跡結(jié)果顯示Au（PPh3）PT 可以明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 前體減少，活化帶增多；PARP 切割帶出現(xiàn)，表明Au（PPh3）PT 導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制與caspase 系統(tǒng)的激活有關(guān)，見(jiàn)圖4。

圖4 Au（PPh3）PT 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的改變Fig.4 Au（PPh3）PT resulted in changes of the apoptosisrelated proteins in gastric cancer cell lines

2.5 Au（PPh3）PT 引起胃癌細(xì)胞泛素化蛋白的改變免疫印跡結(jié)果顯示Au（PPh3）PT 明顯引起胃癌細(xì)胞總的及K48-鏈接的多聚泛素化蛋白的聚集增加，表明Au（PPh3）PT 能夠抑制胃癌細(xì)胞的蛋白酶體功能，見(jiàn)圖5。

3 討論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（the ubiquitin-proteasome system，UPS）降解細(xì)胞內(nèi)80%以上的蛋白［9］，不僅能清除錯(cuò)誤的蛋白，還對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA 修復(fù)等發(fā)揮重要作用［10-11］。UPS 功能障礙與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、心血管系統(tǒng)疾病、病毒感染及腫瘤等［12-15］。多種腫瘤細(xì)胞蛋白酶體活性異常增高，表明這些腫瘤細(xì)胞比非腫瘤細(xì)胞更依賴(lài)UPS 來(lái)抵御細(xì)胞壓力，靶向UPS 可以治療多種腫瘤［16-18］。但靶向UPS 用于胃癌治療的研究較少，效果不確切，需要更多研究證實(shí)［19-20］。

圖5 Au（PPh3）PT 引起胃癌細(xì)胞泛素化蛋白的聚集增加Fig.5 Au（PPh3）PT induced increasing of ubiquitinated proteins in gastric cancer cell lines

蛋白酶體抑制劑分為20S 蛋白酶體抑制劑和DUB 抑制劑。硼替佐米是首個(gè)被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤的20S 蛋白酶體抑制劑，取得了很好的療效，但其耐藥和副作用的問(wèn)題有待解決［21-22］。與20S 蛋白酶體抑制劑相比，大部分DUB 抑制劑只針對(duì)一部分DUB，具有更好的特異性和選擇性，用于腫瘤治療具有重要意義［23］。DUB 抑制劑受到學(xué)者的高度關(guān)注，其應(yīng)用前景非常廣闊。但目前還沒(méi)有用于臨床治療疾病的藥物。

Au（PPh3）PT 為課題組研發(fā)合成的一價(jià)金離子化合物，研究證實(shí)其有效抑制19S 蛋白酶體相關(guān)DUB（UCHL5 和USP14）及胞漿內(nèi)部分DUB（USP7，USP10，USP15，USP25）的活性［8］，是一個(gè)潛在用于抗腫瘤的DUB 抑制劑。筆者推測(cè)Au（PPh3）PT 或許可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究對(duì)Au（PPh3）PT 對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Au（PPh3）PT 確實(shí)可以有效抑制胃癌細(xì)胞的活力，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性。形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Au（PPh3）PT 可使胃癌細(xì)胞凋亡率明顯增加。以上表明Au（PPh3）PT 能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的毒性作用，是一個(gè)潛在的抗胃癌藥物。

泛素分子有76 個(gè)氨基酸殘基，其序列高度保守，全長(zhǎng)包含7 個(gè)賴(lài)氨酸位點(diǎn)（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和1 個(gè)C 端的甘氨酸位點(diǎn)，其中48位賴(lài)氨酸鏈接（K48-）被認(rèn)為與蛋白酶體降解有關(guān)［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)Au（PPh3）PT 可以使總的及48 位鏈接的泛素化蛋白大量聚集，表明Au（PPh3）PT 抑制了胃癌細(xì)胞UPS 活性。有報(bào)道［23］抑制腫瘤細(xì)胞的UPS 活性可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，本研究結(jié)果也表明Au（PPh3）PT 通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞UPS的活性從而誘導(dǎo)其凋亡。

Caspase-8 和caspase-9 是凋亡啟動(dòng)子，其中caspase-8 可以啟動(dòng)死亡受體介導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡通路，而caspase-9 可以啟動(dòng)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路，兩者都可激活下游的凋亡效應(yīng)子caspase-3，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡［26］。本研究結(jié)果顯示Au（PPh3）PT 可以明顯引起caspase-3、caspase-8、caspase-9 前體減少，活化的切割帶相應(yīng)增多，表明Au（PPh3）PT 通過(guò)影響caspase 通路從而引起胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究對(duì)Au（PPh3）PT 對(duì)胃癌細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制進(jìn)行探討，研究發(fā)現(xiàn)Au（PPh3）PT 明顯抑制胃癌細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)其凋亡，機(jī)制與激活caspase 系統(tǒng)和抑制UPS 活性有關(guān)。本研究為DUB 抑制劑用于胃癌的治療提供新的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)尚存諸多不足，如缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)有待進(jìn)一步開(kāi)展；同時(shí)更多的蛋白酶體抑制劑對(duì)胃癌的作用有待探索和比較，以期找出高效低毒的抗胃癌藥物，改善胃癌患者的生存率和生存質(zhì)量。