CDKN3和FOXA1 mRNA在直腸癌中的表達(dá)關(guān)系及意義

王 凡，劉 偉，李 強(qiáng)，王建勛，張四新

(1.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院普外科，河北 唐山 0630002.河北省安國(guó)市醫(yī)院普外科，河北 安國(guó) 0712003.解放軍陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院普外科，河北 保定 071000)

直腸癌是指直腸乙狀結(jié)腸交界處至齒狀線之間、原發(fā)于直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。近年來(lái)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，且其發(fā)病有年輕化趨勢(shì)。2018年全球范圍內(nèi)診斷為結(jié)直腸癌的患者超過180萬(wàn)，占所有癌種的10.2%，死亡病例超過86萬(wàn)，成為全球發(fā)病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤[1]。近年來(lái)直腸癌的早期診斷方法有了提高和進(jìn)步，但直腸癌早期臨床癥狀如排便習(xí)慣、大便性狀的改變相對(duì)比較隱匿，容易被患者忽視[2]，因此提高早期檢測(cè)甄別技術(shù)、確定明確標(biāo)志物迫在眉睫。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)為雙重特異性蛋白磷酸酶家族成員，可使CDK1/2去磷酸化并失活[3]，其表達(dá)異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[4]，但在直腸癌中如何表達(dá)鮮有描述。叉頭框蛋白A1(fork head box protein A1，F(xiàn)OXA1)基因位于人染色體14q21.1站點(diǎn)，參與代謝過程、信號(hào)調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期相關(guān)基因的啟動(dòng)，與多種腫瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)[5]，但FOXA1在直腸癌發(fā)病中的作用尚不明確。因此研究針對(duì)CDKN3與FOXA1 mRNA在直腸癌中表達(dá)如何這一問題探究其臨床意義，以期兩者可以作為直腸癌檢查的輔助檢查基因。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年11月至2020年3月在唐山市協(xié)和醫(yī)院和解放軍陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院就診的94例直腸癌患者作為觀察組，男55例，女39例，年齡32～71歲，平均年齡(59.46±6.09)歲。另選取同時(shí)期在醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康人群95例作為對(duì)照組，男54例，女41例，年齡38～73歲，平均年齡(60.32±7.81)歲。兩組性別、年齡相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究分別經(jīng)唐山市協(xié)和醫(yī)院、解放軍陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按照《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》結(jié)直腸癌組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]，高級(jí)別直腸癌：0～49%腺管形成；低級(jí)別直腸癌：>95%腺管形成、50～95%腺管形成。其中低級(jí)別直腸癌患者36例，高級(jí)別直腸癌患者58例。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(第七版)[7]，其中Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期49例。分化程度：中高分化51例，低分化43例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)MRI常規(guī)檢查、病理切片確診為直腸癌患者；②在進(jìn)行研究前1個(gè)月內(nèi)未服用任何影響消化排泄藥物；③既往無(wú)其他惡性腫瘤病史；④臨床資料完整，且取得患者家屬同意和配合，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)直腸息肉、直腸腺瘤；②克羅恩病、血吸蟲病；③合并深靜脈血栓、凝血障礙性疾??；④合并其他惡性腫瘤者；⑤合并患有心臟、肝、腎等疾病者；⑥自身免疫疾病患者。

1.2主要試劑與儀器:Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司，批號(hào)TR205-50、TK223-07)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(杭州主諾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)RT0418-09)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)7900)。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集:所有受試人員空腹>8h，均于清晨采集靜脈血3mL置于促凝試管中，4000r/min離心10min，吸取血清標(biāo)本置于Eppendrof管中，于-20℃保存。

1.3.2qRT-PCR測(cè)定CDKN3與FOXA1 mRNA表達(dá)量:從-20℃取出血清樣本，用Trizol試劑提取血清總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100μLDEPC水，檢測(cè)所得RNA純度及完整度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20℃保存。qRT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系20μL)：cDNA模板2 μL，10 μL2×SYBR Green PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DEPC水6 μL，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的上下游引物，以GAPDH為內(nèi)參，引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成，序列見表1，反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 10 s、60℃ 90 s，45個(gè)循環(huán)。使用ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析，根據(jù)各樣本平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CDKN3與FOXA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 CDKN3和FOXA1基因RT-PCR引物序列

表2 兩組CDKN3 FOXA1 mRNA水平比較

2 結(jié) 果

2.1兩組血清中CDKN3與FOXA1 mRNA表達(dá)比較:觀察組血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

2.2高、低級(jí)別直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達(dá)水平比較:高級(jí)別直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達(dá)量明顯高于低級(jí)別直腸癌患者(P<0.05)。見表3。

2.3CDKN3、FOXA1 mRNA與直腸癌臨床病理特征的關(guān)系:將觀察組血清CDKN3、FOXA1 mRNA的表達(dá)以其中位值分為兩組，高于中位值者為高表達(dá)組，低于中位值者為低表達(dá)組。直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達(dá)水平與性別、年齡均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表4。

表3 高低級(jí)別直腸癌患者血清中CDKN3與FOXA1mRNA的表達(dá)

表4 直腸癌患者血清中CDKN3 FOXA1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.4血清中CDKN3、FOXA1 mRNA對(duì)高、低級(jí)別直腸癌患者的診斷價(jià)值:以血清中CDKN3、FOXA1 mRNA水平為檢測(cè)變量繪制ROC曲線，CDKN3 mRNA診斷高、低級(jí)別直腸癌的ROC曲線下面積為0.839(95%CI：0.759～0.919)，截?cái)嘀禐?.317，靈敏度為63.8%，特異性為94.4%；FOXA1 mRNA診斷高、低級(jí)別直腸癌的ROC曲線下面積為0.853(95%CI：0.777～0.929)，截?cái)嘀禐?.740，靈敏度為70.7%，特異性為97.2%。詳見圖1。

圖1 血清中CDKN3、FOXA1 mRNA對(duì)高、低級(jí)別直腸癌患者的診斷價(jià)值

3 討 論

近年來(lái)，我國(guó)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)，隨著城市化進(jìn)程的加速，城市地區(qū)較農(nóng)村地區(qū)高發(fā)，又多因部位隱秘，患者常忽視其危險(xiǎn)性，發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期。早期直腸癌可無(wú)明顯癥狀，但病情發(fā)展到一定程度可出現(xiàn)糞便性狀及排便習(xí)慣改變、腹痛或腹部不適、腹部腫塊、腸梗阻、貧血及全身出現(xiàn)消瘦、乏力、低熱等癥狀[8]。盡管最近在治療直腸癌的新型腫瘤藥物方面取得了令人矚目的進(jìn)展，有學(xué)者認(rèn)為如果直腸癌患者不進(jìn)行外科手術(shù)切除，幾乎不能實(shí)現(xiàn)治愈[9]。因此能夠及早檢測(cè)出直腸癌危險(xiǎn)標(biāo)志物，對(duì)于直腸癌診治具有重要意義。

CDKN3是一種雙重特異性蛋白磷酸酶，可使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶去磷酸化，因此作為一種細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，其失調(diào)或突變與多種癌癥有關(guān)[10,11]。如CDKN3呈高表達(dá)用于診斷宮頸癌的敏感性及特異性可分別達(dá)到93%、96%，對(duì)癌前診斷具有重要價(jià)值[12]。Chang等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，CDKN3高表達(dá)與鼻咽癌病情進(jìn)展有關(guān)，可用于評(píng)估危險(xiǎn)分層的輔助手段，也可能成為潛在治療靶點(diǎn)。FOXA1是FOX家族中的一員，F(xiàn)oxA家族與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系是近來(lái)研究的熱點(diǎn)，作為轉(zhuǎn)錄因子與惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在早期器官形成、機(jī)體代謝及穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用[14]。有學(xué)者[15]經(jīng)研究表明FOXA1表達(dá)可以被看成為一種腫瘤低侵襲的特征，說明FOXA1有可能成為預(yù)后的良好標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，推測(cè)CDKN3、FOXA1可能參與直腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程。高級(jí)別直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達(dá)量明顯高于低級(jí)別直腸癌患者，表明CDKN3、FOXA1可能促進(jìn)癌細(xì)胞分化與增殖，可能用于預(yù)測(cè)直腸癌病情進(jìn)展。

本研究另行二者與臨床病理特征的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表達(dá)水平與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，驗(yàn)證了二者參與直腸癌病情的發(fā)展。以血清中CDKN3、FOXA1 mRNA水平為檢測(cè)變量繪制ROC曲線診斷高、低級(jí)別直腸癌的曲線下面積分別為0.839、0.853，截?cái)嘀捣謩e為5.317、0.740，靈敏度及特異性均較高，因此本研究認(rèn)為CDKN3、FOXA1 mRNA對(duì)高、低級(jí)別直腸癌診斷具有一定價(jià)值，而且為進(jìn)一步提高對(duì)患者的診斷準(zhǔn)確度，臨床可考慮將兩者聯(lián)合分析以提高效能。

綜上所述，直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表達(dá)量上升，且高級(jí)別直腸癌患者二者表達(dá)量顯著高于低級(jí)別直腸癌患者，CDKN3、FOXA1 mRNA參與直腸癌病情發(fā)展，對(duì)高、低級(jí)別直腸癌診斷具有一定價(jià)值。但本研究也具有一定缺陷性，如樣本數(shù)過少，后期應(yīng)過大樣本量或擴(kuò)大地域進(jìn)行分析，深入探究?jī)烧咴谥蹦c癌中的作用機(jī)制，以求得到更準(zhǔn)確的研究結(jié)果。