CIAPIN1通過抑制ERK1/2途徑對膀胱尿路上皮癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用研究

袁曉菲，彭洪濤

(1.河北省保定市第一醫(yī)院泌尿外科，河北 保 定 071000 2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017)

尿路上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)主要由上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)和膀胱尿路上皮癌(Bladder urothelial carcinoma ，BC)組成。據(jù)估計，2018年美國新增UC病例為8.5萬，相關(guān)死亡病例為1.8萬。UC分別占男性和女性最常見惡性腫瘤的第4和第12位[1]。多發(fā)性病變、高復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是UC的典型特征。盡管外科技術(shù)不斷進(jìn)步，術(shù)前、術(shù)后輔助治療不斷發(fā)展，但近年來UC患者的長期生存率并沒有明顯改變[2]。因此，探究UC的發(fā)病機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)對UC的治療具有重要意義。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡抑制因子1(Cytokine-induced apoptosis inhibitor 1，CIAPIN1)是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、DNA斷裂和活性氧生成等細(xì)胞過程[3]。已有研究表明，CIAPIN1在膀胱癌組織中高表達(dá)，CIAPIN1在膀胱癌中的表達(dá)與病理分級、臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinases，ERK)，包括ERK1和ERK2，其通過磷酸化激活后，ERK蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中傳遞信號。CIAPIN1通過抑制ERK1/2途徑磷酸化，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)降解過程[5]。目前，關(guān)于CIAPIN1在BC中的具體作用機(jī)制還尚未可知。因此，本研究旨在探究CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用及其作用是否通過ERK1/2途徑實現(xiàn)，以期為明確CIAPIN1在BC中的具體作用機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的UC治療靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料：膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系J82、T24和UM-UC-3購自美國模式培養(yǎng)物研究所；人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1購自上海酶研生物科技有限公司；ERK1/2途徑抑制劑U0126購自美國萊恩生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；陰性對照(NC)和siRNA-CIAPIN1(si-CIAPIN1)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(takara中國)；CIAPIN1抗體購自英國Abcam公司；p-ERK1/2、ERK1/2和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Apollo?567購自廣州市銳博生物科技有限公司；基質(zhì)膠購自美國康寧(上海)有限公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：J82、T24和UM-UC-3細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SV-HUC-1細(xì)胞用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2天更換一次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，0.25%胰酶液消化細(xì)胞后，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞活力：將對數(shù)期生長的T24細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，將細(xì)胞分為0μM組、5μM組、10μM組、20μM組、40μM組和80μM組，每組設(shè)置3個重復(fù)。按照分組，向細(xì)胞中添加不同濃度U0126，0μM組添加等量PBS。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，向每孔細(xì)胞中加入10μLCCK-8，37℃條件下孵育3h。酶標(biāo)儀測定各孔在450nm處的光密度(OD)值。細(xì)胞活力(%)=實驗組OD450nm /0μM組OD450nm×100%。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染：對數(shù)期生長的T24細(xì)胞按4×105個/孔密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、NC組和si-CIAPIN1組，按照Lipofectamine2000TM說明書進(jìn)行NC和si-CIAPIN1的轉(zhuǎn)染。另外，將細(xì)胞隨機(jī)分為NC組、si-CIAPIN1組和si-CIAPIN1+ U0126組。按照分組，向細(xì)胞中添加U0126(20μM)，隨后按照Lipofectamine2000TM說明書進(jìn)行NC和si-CIAPIN1的轉(zhuǎn)染。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h后，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4qRT-PCR檢測細(xì)胞CIAPIN1 mRNA表達(dá)水平：收集SV-HUC-1、J82、T24和UM-UC-3細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR實驗。反應(yīng)條件：95℃、30s；95℃、5s，58℃、30s，40個循環(huán)；95℃、15s；58℃、30s；95℃、15s。CIAPIN1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算其mRNA表達(dá)。CIAPIN1上游引物：5’-CACCAAGAAGTCTTCTCCTTCAGTG-3’，CIAPIN1下游引物：5’-GCTGAGAGGGTCCACAGCT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，GAPDH下游引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞CIAPIN1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達(dá)水平：收集SV-HUC-1、J82、T24、UM-UC-3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的T24細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，BCA法測定上清液的蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，加入CIAPIN1(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶2000)、ERK1/2(1∶1000)和GAPDH(1∶2000)抗體，4℃孵育過夜。二抗(1∶5000)室溫孵育1h后，滴加ECL發(fā)光液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測蛋白條帶。

1.2.65-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)標(biāo)記實驗檢測細(xì)胞增殖：對數(shù)期生長的T24細(xì)胞以2×105個/孔數(shù)量接種于24孔板中，按照1.4所示進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48h后，根據(jù)說明書，向細(xì)胞中添加EdU至終濃度為10μM。繼續(xù)培養(yǎng)2h后，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15min，0.5%Triton X-100穿透20min， Apollo?567避光染色30min，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染核5min。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞，其中藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，紅色熒光代表EdU陽性細(xì)胞。

1.2.7細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移：對數(shù)期生長的T24細(xì)胞以2.5×105個/mL細(xì)胞密度接種于6孔板，每孔2mL，細(xì)胞置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h。20μL槍頭沿著直尺，垂直于6孔板，進(jìn)行細(xì)胞劃痕。PBS洗去漂浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后拍照，Image J軟件分析細(xì)胞遷移距離。

1.2.8Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲：基質(zhì)膠用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋。取100μL稀釋液加入各上腔室中，37℃孵育至凝固。上腔室加入100μLT24細(xì)胞懸液(5×104個細(xì)胞)，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中的表達(dá)：qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果顯示：與SV-HUC-1組相比，T24、UM-UC-3和J8兩組細(xì)胞中CIAPIN1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，其中，T24組細(xì)胞變化最為明顯，因此選取T24細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞增殖的影響：EdU實驗結(jié)果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 EdU實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞增殖的影響(×400)

2.3CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響：細(xì)胞劃痕和Transwell實驗結(jié)果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細(xì)胞遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)。見圖3和圖4。

圖3 細(xì)胞劃痕實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞遷移的影響(×100)

圖4 Transwell實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞侵襲的影響(×400)

2.4CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞ERK1/2途徑的影響：Western blot檢測結(jié)果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細(xì)胞p-ERK1/2 / ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot實驗檢測CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞ERK1/2途徑的影響

2.5U0126逆轉(zhuǎn)si-CIAPIN1對ERK1/2途徑的作用：CCK-8實驗結(jié)果顯示：與0μM組相比， 40μM組和80μM組T24細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，而5μM、10μM和20μM差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6，因此，后續(xù)實驗U0126的使用濃度為20μM。Western blot實驗結(jié)果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細(xì)胞中p-ERK1/2 / ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與si-CIAPIN1組相比，si-CIAPIN1+ U0126組細(xì)胞p-ERK1/2 / ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖7。

2.6U0126逆轉(zhuǎn)si-CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的作用：EdU、細(xì)胞劃痕和Transwell實驗結(jié)果顯示：與NC組相比，si-CIAPIN1組細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)、遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)；與si-CIAPIN1組相比，si-CIAPIN1+ U0126組細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)、遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)。見圖8、圖9和圖10。

圖6 CCK-8檢測U0126對T24細(xì)胞活力的影響

圖7 Western blot檢測U0126對細(xì)胞ERK1/2途徑的作用

圖8 EdU實驗檢測U0126對細(xì)胞增殖的影響(×400)

圖9 細(xì)胞劃痕實驗檢測U0126對細(xì)胞遷移的影響(×100)

圖10 Transwell實驗檢測U0126對細(xì)胞侵襲的影響(×400)

3 討 論

膀胱尿路上皮癌(BC)是世界上第九大常見的惡性腫瘤。盡管多數(shù)晚期BC患者通過一線鉑類化療后疾病控制率(DCR)可達(dá)大概65%～75%，但由于存在化療耐藥，他們的疾病無進(jìn)展生存期(PFS)及總生存期(OS)往往較短。經(jīng)過一線化療后，只有約25%～55%的患者有機(jī)會接受二線治療，但很多二線治療結(jié)局因疾病進(jìn)展較快，而未能達(dá)到治療標(biāo)準(zhǔn)[6]。因此，探尋BC的發(fā)病機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)對于改善BC疾病現(xiàn)狀具有重要意義。CIAPIN1被稱為抗凋亡分子，與包括Bcl-2和caspase家族成員在內(nèi)的一系列凋亡分子沒有序列同源性。CIAPIN1已成為多種人類癌癥診斷、預(yù)后和治療靶標(biāo)的候選指標(biāo)[7]。因此，本研究以BC為研究對象，旨在探究CIAPIN1對BC的作用及其可能的機(jī)制，以期為BC的診斷和靶標(biāo)治療提供新的科學(xué)資料。

CIAPIN1在不同癌癥中發(fā)揮著抗腫瘤或者促腫瘤作用。研究表明，CIAPIN1在人肺癌組織中顯著上調(diào)，敲低CIAPIN1可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[7]。CIAPIN1參與調(diào)控三陰性乳腺癌的多藥耐藥性，hsa-miRNA-143-3p通過靶向結(jié)合CIAPIN1提高三陰性乳腺癌細(xì)胞對化療藥物敏感性[8]。卵巢癌組織中CIAPIN1高表達(dá)，干擾CIAPIN1后可降低卵巢癌細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。但在肝癌中，CIAPIN1發(fā)揮著抗腫瘤作用，過表達(dá)CIAPIN1可抑制肝癌細(xì)胞增殖和集落形成能力[10]。有研究表明，膀胱癌中CIAPIN1高表達(dá)，CIAPIN1的mRNA表達(dá)與增殖標(biāo)志基因Cyclyin D1的mRNA表達(dá)呈正相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲低CIAPIN1后可抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，該結(jié)果說明，CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌中發(fā)揮著促腫瘤作用。

在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，CIAPIN1通過調(diào)控Akt、MAPK、NF-κB和細(xì)胞凋亡信號通路參與細(xì)胞生存、DNA斷裂和活性氧生成的調(diào)節(jié)[12]。目前，在腫瘤相關(guān)的研究中，CIAPIN1對ERK1/2途徑的調(diào)控作用研究較為廣泛。ERK1(44kDa)及其同源亞型ERK2(42 kDa)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理活動[13]。已有研究證明，在人慢性髓系白血病細(xì)胞中，敲低CIAPIN1后，ERK1/2磷酸化水平上調(diào)[14]。同樣的，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)CIAPIN1可抑制ERK1/2磷酸化水平[15]。然而，關(guān)于CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)ERK1/2通路的作用的資料非常缺乏。本研究結(jié)果顯示，敲低CIAPIN1后，膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平升高，而ERK1/2途徑抑制劑U0126處理可逆轉(zhuǎn)敲低CIAPIN1后ERK1/2磷酸化水平的升高，逆轉(zhuǎn)敲低CIAPIN1對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，CIAPIN1通過抑制ERK1/2磷酸化促進(jìn)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果為明確CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌中的作用及發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)提供了新的科學(xué)依據(jù)。