異氟醚對腦缺血再灌注大鼠側(cè)支循環(huán)形成及Notch通路的影響

張 敏，項明瓊，油文靜，伍 璀

(1.同濟大學附屬楊浦區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，上海 200082 2.復旦大學附屬華山醫(yī)院北院麻醉科，上海 200082)

腦中風是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，又稱腦卒中或腦血管意外，具有極高的病死率和致殘率，主要分為出血性腦中風(腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)和缺血性腦中風(腦梗塞、腦血栓形成)兩大類，以腦梗塞最為常見[1]。腦缺血/再灌注(I/R)損傷包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期間的繼發(fā)性損傷，可能形成腦水腫并加重由多種因素引起的腦損傷，包括細胞膜損傷，興奮性氨基酸毒性和中性粒細胞活化[2]。顱內(nèi)側(cè)支循環(huán)在缺血性中風的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后中起著極其重要的作用。研究表明，異氟醚常用于鎮(zhèn)靜和麻醉處理的缺氧缺血性腦病，并激活神經(jīng)元的多核或抑制某些神經(jīng)信號通路，異氟醚處理可以減少缺氧缺血性腦損傷，并起到類似于缺血預(yù)處理的作用[3]。Notch家族是多功能相互作用的細胞因子超家族，由30多種蛋白質(zhì)組成。在細胞中，Notch家族成員涉及一系列由前體蛋白產(chǎn)生的生物學效應(yīng)；Notch也通過兩種形式分泌到細胞外膜中[4]。Notch1信號轉(zhuǎn)導過程涉及I型受體的激活，Smad蛋白(Smad)、磷酸化的Smad蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)組合從Smad復雜易位到核調(diào)節(jié)mRNA下游信號蛋白的轉(zhuǎn)錄。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)也是Notch1調(diào)控下的細胞因子[5]。本研究擬探討異氟醚對腦缺血再灌注大鼠側(cè)支循環(huán)形成及Notch通路的影響，為腦缺血再灌注的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑及儀器:異氟醚(美國sigma公司，批號M5474)；依達拉奉注射液(國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司，規(guī)格30mg/支，批號20190813)；Trlzol試劑、cDNA合成試劑盒(杭州博日科技有限公司，批號BSC51M1、BSB09M1)；SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，批號DRR041A)；放射免疫沉淀分析裂解液(北京欣華綠源科技有限公司，批號SS0892；BCA蛋白測定試劑盒(美國Pierce公司，批號BI548854)；10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膜(碧云天生物技術(shù)研究所，批號EN545465)；聚偏二氟乙烯膜(美國賽默飛世公司，批號BT12654)；Notch1、VEGF、β-actin一抗(美國Abcam公司，批號ab46182、ab39973、ab00113)；辣根過氧化物酶標記的二抗(西化儀(北京)科技有限公司，批號BBY193)；增強的化學發(fā)光檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號HR0340-UHF)。WE098型病理包埋機、WS96病理切片機(德國徠卡公司)；CKX53型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；ABI7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；TZL-650WK型超聲破碎儀(蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司)；GelView 5000 Pro型凝膠成像分析系統(tǒng)(廣州博鷺騰生物科技有限公司)。

1.2實驗動物及分組:清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠90只，年齡8周；重量180～220g，不拘雌雄，由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(云)2018-0012，動物質(zhì)量合格證號：SC-19061209。本研究經(jīng)同濟大學附屬楊浦區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24℃，濕度50～60%，光照12/12循環(huán)；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠按隨機數(shù)字表法分成5組：對照組、模型組、依達拉奉組(3mg/kg)、異氟醚低劑量組(50μg/kg)、異氟醚高劑量組(100μg/kg)，每組18只。

1.3動物模型制備及給藥:模型組、依達拉奉組、異氟醚低、高劑量組腹腔注射戊巴比妥腹麻醉后，通過大腦中動脈阻塞(MCAO)方法誘發(fā)局灶性腦缺血-再灌注損傷。對照組的大鼠接受相同的手術(shù)程序，只是未阻塞頸動脈。依達拉奉組、異氟醚低、高劑量組造模成功后第1天開始分別腹腔注射3mg/kg的依達拉奉、50μg/kg的異氟醚、100μg/kg的異氟醚，(給藥體積均為10mL/kg)，每天1次，持續(xù)給予1周，對照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水(給藥體積10mL/kg)。

1.4大鼠腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度及病理結(jié)果觀察:實驗結(jié)束后處死大鼠，獲取腦缺血再灌注區(qū)域組織，HE染色常規(guī)制作病理切片；計數(shù)鏡下微血管數(shù)目并觀察腦缺血再灌注區(qū)域病理改變。

1.5神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除及平衡木過桿實驗:實驗結(jié)束后，以盲控方式記錄缺血性損傷后的每只大鼠的神經(jīng)運動功能評分，采用以下評分制度：0分，未見任何神經(jīng)功能缺失；1分，拿著尾巴提起老鼠前爪未能伸展；2分，行走時，身體右傾或向右旋轉(zhuǎn)；3分，行走時，身體向右側(cè)跌倒；4分，無法自發(fā)行走，或意識水平降低；得分越高表示神經(jīng)運動功能越差。依據(jù)相關(guān)文獻對大鼠行雙側(cè)貼紙去除及平衡木過桿實驗[6]。

1.6大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA表達的測定:Trlzol試劑從腦缺血再灌注區(qū)域組織中分離總RNA，在提取總RNA后進行逆轉(zhuǎn)錄，使用逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。在ABI7500型PCR儀上使用SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成。序列如下：Notch1上游(5'-CTGGAGCCAGCATGAATCCAG-3')和下游(5'-TTCTTCTCTTCTCCACGGTCA-3')；VEGF上游(5'-AGAAATGGTGCCTGGACACCTCAT-3')和下游(5'-TGGTCCCGGTTGTACAGTCCTAAT-3′)；β-actin上游(5'-AGAAATGGTGCCTGGACACCTCAT-3')和下游(5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGATC-3')。β-actin為內(nèi)參基因。PCR總反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR Premix Ex Taq 8 μL，cDNA模板 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，去離子水8 μL。熱循環(huán)參數(shù)為：97℃ 45s，56℃ 42s，73℃ 40s，70℃ 15min。每個樣品進行三次測量。2-△△Ct法用于計算Notch1、VEGF mRNA的相對表達水平。

1.7大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白表達的測定:將腦缺血再灌注區(qū)域組織通過超聲破碎儀壓碎，并與放射免疫沉淀分析裂解液混合。然后，使用BCA蛋白測定試劑盒確定相關(guān)蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。將含有蛋白質(zhì)的膜在室溫下孵育2h，然后與Notch1、VEGF、β-actin一抗(稀釋比均為1∶1000)一起在4℃過夜孵育。然后，將膜用含Tween 20的Tris緩沖鹽水洗滌三次，并與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000稀釋)孵育，使用增強的化學發(fā)光檢測試劑盒進行顯影。使用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描和分析蛋白質(zhì)印跡帶。β-actin作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度比較:與對照組比較，模型組腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度升高(P<0.05)；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度高于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度與依達拉奉組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度比較

2.2各組大鼠神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除及平衡木過桿時間比較:與對照組比較，模型組神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間升高(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間降低(P<0.05)；且異氟醚高劑量組神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間低于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間與依達拉奉組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)運動功能評分雙側(cè)貼紙去除及平衡木過桿時間比較

2.3各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的比較:對照組神經(jīng)元細胞完整；模型組海馬區(qū)可見大量壞死神經(jīng)元，神經(jīng)細胞核固縮，有明顯炎癥細胞浸潤；依達拉奉組、異氟醚高劑量組神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥細胞浸潤減少；異氟醚低劑量組仍可見明顯炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.4各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA表達水平比較:與對照組比較，模型組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA表達升高(P<0.05)；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA表達高于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA表達與依達拉奉組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1 VEGF mRNA表達水平比較

2.5各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白表達水平比較:與對照組比較，模型組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白表達升高(P<0.05)；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白表達高于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白表達與依達拉奉組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1 VEGF蛋白表達水平的比較

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)病理圖(HE染色，200倍)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF蛋白印跡圖

3 討 論

異氟醚是臨床上廣泛使用的吸入麻醉藥之一，已證實異氟醚具有神經(jīng)保護作用?，F(xiàn)有研究表明低濃度的異氟醚預(yù)處理可以在較短的時間內(nèi)為缺血性損傷提供保護[7]。研究發(fā)現(xiàn)異氟醚可抑制血小板聚集和粘附并減少炎癥；在中風后彌漫性腦腫脹的早期，高劑量的異氟醚可以增加微循環(huán)并改善總體預(yù)后，減少梗塞體積并激活神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌。本次研究顯示，異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域微血管密度高于模型組；這說明異氟醚能明顯促進腦缺血再灌注大鼠側(cè)支循環(huán)形成。此外對大鼠神經(jīng)運動功能分析顯示，異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組神經(jīng)運動功能評分、雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間低于模型組；說明異氟醚對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)運動功能具有恢復作用，側(cè)支循環(huán)是腦缺血再灌注的重要預(yù)后因素。研究表明，與沒有側(cè)支循環(huán)的患者相比，代償性側(cè)支循環(huán)良好的急性腦梗死患者灌注面積小，早期臨床癥狀明顯改善[8]。此外，側(cè)支循環(huán)有助于預(yù)測血管內(nèi)治療的療效以及最終的梗塞面積和出血性轉(zhuǎn)化的風險。這些研究均與本研究結(jié)果一致。此外，病理學結(jié)果顯示，依達拉奉組、異氟醚高劑量組神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥細胞浸潤減少；異氟醚低劑量組仍可見明顯炎癥細胞浸潤，說明異氟醚能減輕腦缺血再灌注大鼠缺血梗死灶炎癥反應(yīng)。

Notch1在神經(jīng)干細胞中高度表達，并調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育和樹突形態(tài)，Notch1信號通路在體內(nèi)和體外缺血后均被激活，具有神經(jīng)修復功能。研究表明，Notch1的激活可以促進缺血性中風后神經(jīng)細胞的增殖和分化。此外，Notch信號傳導促進中風后巨噬細胞的活化和樹突狀細胞的分化。Notch信號傳導有助于維持核因子κB(NF-κB)活化，并增強炎癥反應(yīng)，Notch1可在局灶性腦缺血后激活小膠質(zhì)細胞，能夠介導炎癥，清除受損的神經(jīng)元并修復缺血后的損傷[9]。研究表明，Notch1的非典型信號傳導途徑激活了非Smad依賴性的轉(zhuǎn)導途徑，從而改變了細胞的生物學特性，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途徑是非Smad依賴性途徑[10]。作為MAPK信號通路的成員VEGF是細胞增殖和凋亡調(diào)控的關(guān)鍵途徑，VEGF通路是血管生成的重要途徑[11]。本次研究顯示，異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白表達高于模型組；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白表達高于異氟醚低劑量組。這與上述討論一致，同時說明異氟醚可促進大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白表達水平的表達進而激活Notch信號通路。綜上所述，異氟醚能明顯促進腦缺血再灌注大鼠側(cè)支循環(huán)形成；其機制可能與異氟醚可促進大鼠腦缺血再灌注區(qū)域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白的表達進而激活Notch信號通路有關(guān)。