納米氧化鋅對兩種蔬菜種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

林茂宏，沈玫玫，吳佳妮，陳慧玲，徐藝萌，劉維濤*

（1.佛山市環(huán)境保護投資有限公司，廣東 佛山 528051；2.南開大學環(huán)境科學與工程學院污染過程與基準教育部重點實驗室/天津市跨介質復合污染環(huán)境治理技術重點實驗室，天津 300350）

納米材料（Nanomaterials，NMs）是指至少有一維幾何尺寸處于納米尺度范圍內（1～100 nm）的物質，具有比表面積大和表面能高等特點[1-2]。其中，金屬型納米顆粒（Metal-based nanoparticles，MB NPs）是極其重要的一類納米材料，具有金屬材料和納米材料的雙重特性，包括典型的零價金屬納米顆粒和金屬氧化物顆粒等[3-4]。

納米氧化鋅顆粒（ZnO NPs）廣泛應用于塑料、陶瓷、玻璃、水泥、橡膠、電池、防火阻燃劑、化妝品和傳感器等領域[5]。據(jù)估計，全球每年ZnO NPs 的生產量約為550～33 400 t，是應用量居第三位的金屬型納米材料[6]。ZnO NPs 一般通過農業(yè)化學品的施用、大氣沉降、降水和灌溉等途徑進入土壤[7-8]。ZnO NPs 在土壤中的遷移能力較小，最終導致其在土壤中的濃度遠高于大氣和水體[9]，并可被植物吸收和積累，影響植物生長甚至通過食物鏈威脅人體健康[10-11]。

目前，ZnO NPs 對植物的毒理學效應尚未明確[6]，甚至出現(xiàn)截然不同的研究結果[12]。ZnO NPs對瓜兒豆（Cyamopsis tetragonoloba）的生物量、莖長、根長、根面積、葉綠素含量和葉總可溶性蛋白具有顯著的促進作用[13]。亦有研究表明ZnO NPs 提升了香菜（Corian?drum sativum）光合色素含量[8]和萵苣（Lactuca sativa）的生物量及凈光合速率[14]。然而，相關研究證實ZnO NPs及其釋放出來的Zn2+對植物具有一定的毒性[15]。ZnO NPs顯著降低了芥菜（Brassica juncea）的生物量，且造成其根、莖和葉的氧化損傷[16]。Zhang 等[15]研究揭示ZnO NPs 顯著降低了玉米（Zea mays）和黃瓜（Cucumis sati?vus）的根長，但對種子發(fā)芽率無顯著影響。此外，ZnO NPs 降低了80%的根和地上部生物量，ZnO NPs的毒性小于ZnCl的毒性[17]。

種子萌發(fā)是植物生命周期的一個關鍵時期，也是對外界環(huán)境因子最敏感的時期之一[18]，開展種子發(fā)芽試驗有望初步評估污染物對植物的毒理學效應。盡管針對ZnO NPs 的種子發(fā)芽試驗已有報道，但主要集中于水稻（Oryza sativa）[19]、小麥（Triticum aestivum）[20]、玉米（Zea mays）[15]、油菜（Brassica napus）[21]和豇豆（Vi?gna unguiculate）[22]等作物，而對于根菜類蔬菜櫻桃蘿卜（Raphanus sativusL.）和葉菜類蔬菜小白菜（Brassi?ca chinensisL.）的種子發(fā)芽試驗研究相對較少。因此，本研究選取在我國廣泛種植的櫻桃蘿卜和小白菜作為供試作物，通過種子發(fā)芽試驗探究ZnO NPs 和ZnSO4對兩種蔬菜作物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，以期為今后ZnO NPs 的毒理學效應、環(huán)境應用及其風險評估提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于南開大學環(huán)境科學與工程學院污染過程與基準教育部重點實驗室進行，該實驗室位于南開大學津南校區(qū)（38°59′15.49″N，117°19′53.08″E），試驗于2017年7—8月進行。供試ZnO NPs 材料購于上海麥克林生化科技有限公司，純度99%，粒徑（30±10）nm。供試小白菜種子購于北京綠金藍育苗有限公司，供試櫻桃蘿卜種子購于北京金丹隆種子有限公司。直徑9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿與濾紙、30%H2O2（優(yōu)級純）以及硫酸鋅（ZnSO4·7H2O，優(yōu)級純）均購自天津海斯凱爾科技發(fā)展有限公司；試驗所用去離子水為實驗室自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 ZnO NPs性能表征

通過場發(fā)射透射電鏡（TEM，日本電子JEM-2800）觀察ZnO NPs 形態(tài)與粒徑分布，利用X 射線粉末衍射儀（XRD，Ulitma Ⅳ）確認納米材料的晶型，通過多站擴展式全自動快速比表面儀（ASAP 2460）測定納米顆粒的比表面積。

1.2.2 ZnO NPs懸浮液的制備

通過向超純水中加入適量的ZnO NPs 制備NPs懸濁液。為避免聚集，基于先前的研究，將溶液在30℃下利用超聲波細胞粉碎機（新芝JY98-ⅢN）進行超聲處理（130 W，20 kHz）30 min，使其均勻分散于高純水中形成納米材料懸浮液。離子溶液由ZnSO4·7H2O 配制，其濃度與相應的納米材料懸浮液的金屬量一致。

1.2.3 預試驗

選取直徑9 cm、鋪有1 層定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿，挑選大小均勻、顆粒飽滿的15 粒小白菜或櫻桃蘿卜種子，用10%的H2O2溶液浸泡30 min 以去除表面細菌，再用去離子水沖洗多次后播種于培養(yǎng)皿，使每顆種子之間的距離不少于1 cm。將處理濃度為0、1、10、100 mg·L-1的ZnO NPs 懸浮液各5 mL 分別加入培養(yǎng)皿中，每個濃度設置3 個重復，將培養(yǎng)皿用封口膜密封后于25 ℃下避光培養(yǎng)。

1.2.4 種子發(fā)芽試驗

種子的選擇和前處理過程與1.2.3 節(jié)相同。試驗共設13 個處理，每個處理3 次重復，ZnO NPs 處理濃度為0、50、100、200、500、700、1 000 mg·L-1（分別標記為CK、N50、N100、N200、N500、N700、N1000），ZnSO4濃度為50、100、200、500、700、1 000 mg·L-1（分別標記為I50、I100、I200、I500、I700、I1000）。將培養(yǎng)皿均放置在恒溫培養(yǎng)箱中于25 ℃下避光培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)皿浸泡在20 mmol·L-1Na2·EDTA 溶液中2 h，然后用自來水和去離子水沖洗，去除黏附于樣品上的污染物。

1.3 測定方法

用天平稱量幼苗的鮮質量，用游標卡尺分別測量根長、芽長并計算抑制率，計算公式為：

其中：A為對照處理根長或芽長；B為污染處理根長或芽長。

試驗期間每日記錄發(fā)芽的種子數(shù)，試驗結束時計算種子發(fā)芽率（GR），其計算公式為：

本試驗中種子幼根或子葉伸出種皮視為萌發(fā)，只有幼根超過1 mm才被記為根長。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有檢測的數(shù)據(jù)均重復3 次，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0對測得數(shù)據(jù)進行計算、處理與統(tǒng)計分析，利用LSD（Least significant difference）法對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，并利用Origin 9.0進行制圖。

2 結果與分析

2.1 ZnO NPs的表征

本試驗所使用納米材料的大小及形態(tài)通過TEM觀察（圖1A），其材料的物相組成及純度使用XRD 進行檢測（圖1B）。從圖1A 中可以清晰地看出ZnO NPs均為比較規(guī)則的圓球狀顆粒，平均粒徑約30 nm。圖1B 中清晰地展示了納米材料的XRD 衍射峰，其中ZnO NPs 樣品的XRD衍射峰尖銳明顯，并且?guī)缀跬耆恢?，?θ為31.769°、34.421°、36.252°處的主衍射峰分別對應JCPDS No.88—2495 標準卡片的（100）、（002）、（101）晶面，沒有任何雜峰，表明該納米材料為六方晶系，結晶度好，純度高。

圖1 納米氧化鋅（ZnO NPs）的透射電鏡圖（A）及X-射線衍射圖譜（B）Figure 1 Transmission electron microscope（A）and X-ray diffraction pattern（B）of ZnO NPs

2.2 ZnO NPs 和ZnSO4對兩種蔬菜種子發(fā)芽率及生物量的影響

發(fā)芽率不僅是衡量種子發(fā)芽能力的最直觀的物理量，也是高等植物毒理試驗的一個重要指標。根據(jù)預試驗結果，兩種蔬菜種子發(fā)芽率均為100%，滿足GB 16715.2—2010規(guī)定的種子質量標準（≥85%）。在發(fā)芽試驗濃度范圍內，各污染濃度處理下兩種蔬菜作物的發(fā)芽率均大于93%（圖2），與對照處理均無顯著差異（P＞0.05），表明ZnO NPs 和ZnSO4對兩種蔬菜發(fā)芽率無顯著影響。

生物量是最直觀反映植物受污染影響的物理量，與發(fā)芽率不同，小白菜幼苗的生物量隨著ZnO NPs 和ZnSO4濃度的增加而降低，表現(xiàn)出明顯的抑制作用（圖3）。盡管ZnO NPs 和ZnSO4對櫻桃蘿卜表現(xiàn)出低濃度促進高濃度抑制（“低促高抑”）的現(xiàn)象，但在最高濃度（1 000 mg·L-1）時，ZnO NPs對櫻桃蘿卜鮮質量降低超過60%。整體而言，ZnO NPs 比ZnSO4對櫻桃蘿卜的毒性更強，而ZnSO4對小白菜生物量的降低作用強于ZnO NPs。

2.3 ZnO NPs 和ZnSO4對櫻桃蘿卜與小白菜根長和芽長的影響

不同濃度的ZnO NPs及ZnSO4均在一定程度上抑制了兩種蔬菜根長和芽長（圖4）。由圖5可知，兩種植物的根長和芽長隨著污染物濃度的升高而逐漸降低，但ZnO NPs及ZnSO4對兩種蔬菜根長的抑制作用強于芽長。相對而言，ZnO NPs 對兩種蔬菜種子根長的抑制作用比ZnSO4更大，且抑制率均隨濃度的升高而增加，在1 000 mg·L-1時最高，達到98%。但ZnSO4對兩種蔬菜芽長的抑制作用則強于ZnO NPs。

圖2 不同處理下櫻桃蘿卜（A）和小白菜（B）發(fā)芽率Figure 2 Germination percentage of Raphanus sativus（A）and Brassica chinensis（B）under different treatments

圖3 不同處理下櫻桃蘿卜（A）和小白菜（B）鮮質量Figure 3 Fresh weight of Raphanus sativus（A）and Brassica chinensis（B）under different treatments

圖4 不同處理下櫻桃蘿卜（A）和小白菜（B）的發(fā)芽形態(tài)Figure 4 Shoot morphology of Raphanus sativus（A）and Brassica chinensis（B）under different treatments

圖5 不同處理下櫻桃蘿卜（A、C）和小白菜（B、D）的芽長及根長Figure 5 Shoot and root length of Raphanus sativus（A，C）and Brassica chinensis（B，D）under different treatments

圖6 不同處理下櫻桃蘿卜（A）和小白菜（B）的根長和芽長抑制率Figure 6 Inhibition rates of root and shoot length of Raphanus sativus（A）and Brassica chinensis（B）under different treatments

如圖6所示，不同濃度ZnO NPs與ZnSO4處理對兩種蔬菜芽長脅迫作用均低于對根長的脅迫作用，甚至在低濃度時出現(xiàn)促進作用。整體而言，ZnO NPs 處理均表現(xiàn)為對櫻桃蘿卜芽長的抑制率明顯高于小白菜（圖6），表明ZnO NPs對櫻桃蘿卜生長的脅迫作用高于小白菜，這與二者對兩種幼苗生物量的影響結果一致，并且對根長的抑制作用明顯強于芽長。

3 討論

目前，金屬型納米顆粒（MB NPs）產生的植物毒性機制尚不明確[23]。MB NPs 可以溶出部分金屬離子，而金屬離子尤其是重金屬離子對植物的毒性已得到普遍證實[24]。對于MB NPs，其生物毒性來自溶解的金屬離子還是納米顆粒自身也是目前NPs 毒性研究中爭議較大的問題之一[25-26]。作為一種具有代表性的金屬氧化物納米材料，ZnO NPs 的植物致毒機制也同樣飽受爭議[27]。有研究認為納米氧化物的生物毒性主要源于所溶出的金屬離子[28-29]，而García-Gómez 等[30]研究結果表明，ZnO NPs 溶解出的Zn2+在植物中優(yōu)先發(fā)揮毒性，但是可能存在Zn2+與ZnO NPs共同對植物產生毒性作用的現(xiàn)象。López-Moreno等[25]研究認為，很難說明ZnO NPs 的植物毒性是否來自納米顆粒，而經(jīng)ZnO NPs 暴露后，大豆組織中的Zn以Zn2+而非ZnO NPs 形式存在。Lin 等[31]研究表明，Zn NPs和ZnO NPs能夠明顯抑制植物發(fā)芽及根生長，但是二者暴露液離心過濾后的上清液則未表現(xiàn)出植物毒性，表明Zn NPs和ZnO NPs的毒性來自納米顆粒而非溶解的Zn2+；而Xiang 等[32]也得出了相似的結果，即ZnO NPs 溶解的Zn2+不是其對大白菜幼苗影響的主要原因。類似地，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度（50～100 mg·L-1）的ZnSO4對兩種蔬菜根長的抑制作用顯著低于相同濃度的ZnO NPs 處理（P＜0.05），而相同濃度的ZnO NPs 溶出的Zn2+濃度低于對比離子處理，表明在低濃度時ZnO NPs 對兩種幼苗根的生物毒性高于Zn2+，這一毒性主要來源于ZnO NPs 自身毒性而非Zn2+毒性；但在高濃度處理下，二者抑制率較為接近，其致毒機理仍需進一步研究。

ZnO NPs 可明顯抑制玉米（Zea maysL.）根的生長，但對于植物的發(fā)芽沒有顯著的影響[31]；類似的研究也發(fā)現(xiàn)ZnO NPs 對苜蓿（Medicago sativaL.）、黑芥（Brassica nigra）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea maysL.）和水稻（Oryza sativaL.）等作物的種子萌發(fā)、植株生長以及產品質量均有負面影響[6，17，33-34]。在本研究中，ZnO NPs 對兩種植物的根長與芽長抑制率與污染物濃度呈正相關（圖6），并且ZnO NPs 對兩種蔬菜種子根長的抑制作用較芽長更強，兩種污染物濃度在1 000 mg·L-1時抑制率均高于95%?？赡茉蚴欠N子萌發(fā)后根部最先伸出種皮，種皮對于種子發(fā)芽前的保護作用，可在一定程度上減少污染物對于種子的毒害作用，從而使得ZnO NPs 對兩種蔬菜發(fā)芽率影響不顯著；但幼苗生長階段，根部相較于地上部與污染物接觸時間最長，接觸面積也最大[35-37]，受污染物脅迫作用比地上部大，從而使得污染物對根長的抑制作用比芽長更強。

4 結論

（1）ZnO NPs 和ZnSO4對櫻桃蘿卜和小白菜的發(fā)芽率均無顯著影響。

（2）不同濃度的ZnO NPs 和ZnSO4均在一定程度上抑制了兩種蔬菜根長和芽長，ZnO NPs 對兩種蔬菜根長的抑制作用比ZnSO4更大，但ZnSO4對兩種蔬菜芽長的抑制作用則強于ZnO NPs。

（3）ZnO NPs比ZnSO4對櫻桃蘿卜的毒性更強，而ZnSO4對小白菜生物量的降低作用強于ZnO NPs。

（4）不同濃度ZnO NPs 與ZnSO4處理對兩種蔬菜芽長脅迫作用均低于對根長的脅迫作用。