乳腺病變剪切波彈性模量與病理基礎(chǔ)的相關(guān)性研究

廉祎，黃瑛

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 超聲科，遼寧 沈陽 110004

引言

乳腺癌具有較高的發(fā)病率和死亡率，在女性因癌癥導(dǎo)致的死亡率中，乳腺癌居第一位，嚴(yán)重威脅著女性的健康[1]。超聲檢查是乳腺疾病最常用的影像學(xué)檢查方法，近年來彈性成像的應(yīng)用，使得常規(guī)超聲對乳腺病變的診斷特異性有了一定的提升[2-4]。剪切波彈性成像（Shear Wave Elastrography，SWE）作為彈性成像方式中應(yīng)用較廣泛的一種，對于軟組織彈性的顯示有著定量、可視化且實(shí)時(shí)顯示的優(yōu)點(diǎn)[5]，其在乳腺良惡性病變的鑒別中有著重要的價(jià)值[6]。大多數(shù)乳腺惡性病變的硬度明顯高于良性病變[7]，但惡性病變硬度高于良性病變的具體原因還未明確。腫瘤的生長是一個(gè)復(fù)雜的過程，乳腺病變的硬度也不會只與單一的因素相關(guān)，與病變中的細(xì)胞數(shù)量、膠原纖維的含量，組織學(xué)上的特點(diǎn)等都可能具有相關(guān)性。找到乳腺病變硬度的相關(guān)因素，就更容易理解硬度在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用SWE技術(shù)對乳腺穿刺患者病變的彈性模量值進(jìn)行測量，穿刺后對標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色做出病理診斷及統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)、Masson染色測定膠原纖維的含量、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）[8]免疫組化染色估算血管密度。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析各個(gè)因素與剪切波彈性模量的相關(guān)性，探究乳腺病灶硬度產(chǎn)生的原因，豐富硬度在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2018年9月至2019年3月來中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院接受超聲引導(dǎo)下乳腺結(jié)節(jié)粗針穿刺的患者42例（經(jīng)GPower3.1軟件估算樣本量），術(shù)前均行常規(guī)超聲檢查及剪切波彈性成像檢查，術(shù)后對所有患者的穿刺病理標(biāo)本進(jìn)行HE染色做出病理診斷并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)對切片進(jìn)行Masson染色及VEGF免疫組化染色，患者年齡20～86歲，平均（45.9±15.9）歲。病灶最大徑0.6～5.8 cm，平均（2.6±1.3） cm。患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與方法

剪切波彈性成像檢測：選用SuperSonic Imagine公司AixPlorer超聲診斷儀，探頭頻率4～15 MHz。常規(guī)超聲檢查結(jié)束后切換到剪切波彈性成像檢查的模式，在測量剪切波彈性模量值時(shí)要避免外界的壓力，囑患者屏住呼吸幾秒鐘并保持安靜。質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)是感興趣區(qū)上方呈均一的藍(lán)色，表示沒有外界的壓力，為使感興趣區(qū)上方呈均一的藍(lán)色，我們可以通過輕提探頭來實(shí)現(xiàn)，當(dāng)感興趣區(qū)上方出現(xiàn)其他顏色時(shí)，輕提探頭調(diào)整此部位的壓力，靜置3 s，使圖像穩(wěn)定后，定幀，橫縱切面各存三張圖。之后用Sonic軟件分析，點(diǎn)擊Q-BOXratio或Trace鍵，手動(dòng)定義感興趣區(qū)，用直徑為2 mm大的感興趣區(qū)先后選取病灶內(nèi)最硬的部位及病灶旁邊正常的乳腺組織，由系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出該感興趣區(qū)的彈性模量最大值、平均值、最小值及病灶與周圍組織比值，每個(gè)病灶進(jìn)行6次測量，最后記錄6次測量結(jié)果的平均值。

病灶內(nèi)細(xì)胞數(shù)量測定：將乳腺組織包埋，切片，脫蠟至水，行HE染色，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。Image-ProPlus6.0圖像處理軟件進(jìn)行定量分析，在高倍鏡（×400）下，按照隨機(jī)選取的方式在每一張細(xì)胞切片上選定5個(gè)視野，計(jì)算每一視野中細(xì)胞的總數(shù)，計(jì)算平均值。

病灶內(nèi)膠原纖維含量測定：將切片脫蠟至水，行Masson染色，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。鏡下膠原纖維呈藍(lán)色；紅細(xì)胞、胞質(zhì)、纖維素等呈紅色；細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。對膠原纖維的定量分析：Image-ProPlus6.0圖像處理軟件進(jìn)行定量分析，在高倍鏡（×400）下，按照隨機(jī)選取的方式在每一張細(xì)胞切片上選定5個(gè)視野，計(jì)算每一視野中膠原纖維累加面積，計(jì)算平均值。

病灶內(nèi)VEGF表達(dá)水平測定：將切片脫蠟至水，行VEGF免疫組化染色，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。細(xì)胞內(nèi)若出現(xiàn)棕黃色顆粒則定義為陽性細(xì)胞，將陽性細(xì)胞所占的百分比和顯色強(qiáng)度結(jié)合評分。在高倍鏡（×400）下，按照隨機(jī)選取的方式在每一張細(xì)胞切片上選定5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比。陽性細(xì)胞所占比例≥75%為4分；50%～75%為3分；25%～50%為2分；1%～25%為1分；＜1%為0分。顯色強(qiáng)度評分：棕褐色為3分；黃色至棕黃色為2分；淺黃色為1分；無著色為0分。兩種評分結(jié)果相乘，得出VEGF的表達(dá)水平[8]，乘積≤1分定義為陰性表達(dá)，＞1分定義為陽性表達(dá)。

以上染色結(jié)果的判定，由病理科2名醫(yī)師共同完成，工作時(shí)對患者乳腺病變的SWE結(jié)果均不了解。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均±值標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，惡性組及良性組病灶的彈性模量、細(xì)胞數(shù)目、膠原纖維面積及VEGF的表達(dá)水平比較采用t檢驗(yàn)，彈性模量與細(xì)胞數(shù)目、膠原纖維含量及VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良惡性乳腺病變的彈性模量值

在42例乳腺病變中，惡性病變23例（54.7%），良性病變19例（45.3%）。乳腺惡性病變彈性模量最大值、平均值、最小值及病灶與周圍組織比值分別（143.56±69.41）、（119.97±66.25）、（84.75±58.51） kPa 及（12.03±7.71）明顯高于良性病變的（50.1±26.91）、（38.18±22.53）、（25.81±18.85） kPa及（3.50±3.19）（t=5.526、5.133、4.206、4.503，P＜0.001），見表 1。

表1 良惡性乳腺病變的彈性模量值對比

2.2 良惡性乳腺病變彈性模量值與病理基礎(chǔ)的相關(guān)性分析

惡性病變中的細(xì)胞數(shù)目（502.57±167.698）個(gè)，明顯小于良性病變中的細(xì)胞數(shù)目（838.11±211.886）個(gè)（t=5.371，P＜0.01）。彈性模量最大值與細(xì)胞數(shù)目呈線性負(fù)相關(guān)（r=-0.630，P＜0.01）。惡性病變中膠原纖維的面積（70114.69±13678.26） μm2明顯大于良性病變中膠原纖維的面積（47022.47±15051.32） μm2（t=5.156，P＜0.01），彈性模量最大值與膠原纖維含量呈線性正相關(guān)（r=0.646，P＜0.01）。在23例惡性病例中VEGF陽性表達(dá)率為82.61%（19/23），在19例乳腺良性疾病中VEGF陽性表達(dá)率為15.8%（3/19）。VEGF蛋白在乳腺惡性病變中表達(dá)明顯高于乳腺良性病變（P＜0.05）。在VEGF蛋白表達(dá)陽性的病例中進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，彈性模量最大值、平均值、最小值及比值均與VEGF蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系（圖1～3）。

圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫塊的病理圖

圖2 乳腺腺病腫塊的病理圖片

圖3 乳腺病變剪切波彈性模量最大值與病理基礎(chǔ)相關(guān)性的散點(diǎn)圖

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[9]，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷尤為重要。在超聲診斷中，硬度的增加在惡性病變與良性病變的鑒別中有著重要的輔助價(jià)值[10-11]。本研究通過對乳腺病變剪切波彈性模量值的定量分析發(fā)現(xiàn)，乳腺惡性病變的彈性模量最大值、平均值、最小值、病灶與周圍組織彈性模量比值均高于良性病變，與先前其他學(xué)者的研究結(jié)果大致相符[6,12-14]，證實(shí)了剪切波彈性成像在乳腺良惡性病變鑒別中的重要作用。

為探究硬度產(chǎn)生的原因，本研究對乳腺病變的彈性模量值與病變內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，膠原纖維含量，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)乳腺病變的彈性模量值與病變中細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與膠原纖維的含量呈正相關(guān)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系。證明了乳腺病變硬度與膠原纖維含量之間密切的相關(guān)關(guān)系，膠原纖維作為構(gòu)成乳腺惡性病變細(xì)胞外基質(zhì)纖維成分中含量最多的成分，其不僅在構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要骨架[15]，增加腫塊的硬度，支撐腫塊維持一定形態(tài)中具有關(guān)鍵作用，研究表明其在腫瘤的生長，侵襲等生物學(xué)行為中也發(fā)揮著重要的作用[16]。Levental等[17]發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變形成的過程中，膠原纖維的表達(dá)逐漸增加，細(xì)胞外基質(zhì)的硬度也逐漸變大。實(shí)際上，其硬度對細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移有著促進(jìn)的作用[18]。我們發(fā)現(xiàn)病變內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的增多對乳腺病變硬度的增加無正向作用，也從側(cè)面證明了乳腺病變的硬度主要由間質(zhì)成分的硬度決定。本研究也證實(shí)了惡性病變與良性病變相比含有更多的膠原纖維，所以我們認(rèn)為乳腺惡性病變硬度增加的病理基礎(chǔ)很有可能是膠原纖維的增多，這也可以與惡性腫瘤生長、侵襲的生物學(xué)行為相聯(lián)系，將硬度增加與惡性病變的病理基礎(chǔ)建立聯(lián)系，使我們更容易理解乳腺病變硬度在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

有研究還發(fā)現(xiàn)乳腺病變的硬度和某些促進(jìn)膠原纖維表達(dá)等的細(xì)胞因子也有緊密的聯(lián)系。Xue等[19]發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變中膠原纖維含量及整合素相互作用蛋白（Kindlin-2）的平均表達(dá)強(qiáng)度均高于乳腺良性病變，Kindlin-2表達(dá)和Emax有相關(guān)性并且Kindlin-2和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，對于乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。彈性成像可以輔助診斷乳腺惡性病變是否伴有腋下淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[20]，對于乳腺惡性病變的分級及對患者的預(yù)后判定都有著重要的意義。李萬[21]研究發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming Growth Factor β1，TGF-β1）呈高表達(dá)，且TGF-β1和膠原纖維含量呈正相關(guān)，提示膠原纖維的合成及分泌受TGF-β1的促進(jìn)。病變的硬度評分也與TGF-β1表達(dá)、膠原纖維含量成正相關(guān)關(guān)系。TGF-β1已被證實(shí)可以用作預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)后因子，所以認(rèn)為硬度的增加也可作為診斷及判斷乳腺癌患者預(yù)后的因素，將硬度與膠原纖維及與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞因子建立聯(lián)系，使得硬度在良惡性的鑒別中具有更可靠的依據(jù)和更廣泛的應(yīng)用。越來越多的研究證明乳腺病變的彈性成像與病理基礎(chǔ)之間具有相關(guān)性[22]，乳腺惡性病變的硬度與其分級、惡性程度、預(yù)后等都具有相關(guān)性。

4 結(jié)論

乳腺病變剪切波彈性模量與病變內(nèi)膠原纖維含量密切相關(guān)，且膠原纖維作為細(xì)胞骨架在乳腺癌的疾病發(fā)展中扮演重要的角色，這使我們更容易理解硬度在臨床應(yīng)用中的價(jià)值，為剪切波彈性模量與乳腺癌的進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后推測等方面的聯(lián)系提供一定的幫助。