二氫楊梅素經(jīng)激活SIRT1-AMPK通路抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積

王紫涵，羅金定，呂慧婕，田英入，何劍琴，奉水東，凌宏艷

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.生理學(xué)教研室; 2. 2017級臨床21班; 3. 公共衛(wèi)生學(xué)院，社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001)

隨著生活水平的提升，肥胖呈逐年上升趨勢，肥胖不僅影響人體的美感，而且給人們的健康造成極大的危害。因此，肥胖已成為世界性亟待解決的問題[1]。

二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)多提取自葡萄科蛇葡萄屬的一種木質(zhì)藤本植物，主要有效成分為黃酮類物質(zhì)，常用于治療與炎癥和氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的疾病[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，DHM可降低血清總膽固醇(serum total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平，增加高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)水平；研究還發(fā)現(xiàn)，DHM可通過調(diào)控去乙?；?(sirtuin1， SIRT1)信號(hào)通路降低肝癌細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的蓄積，進(jìn)一步改善肝細(xì)胞脂肪變性[4]。另有研究顯示： SIRT1可通過LKB1(liver kinase B1)依賴方式介導(dǎo)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的作用[5]： AMPK可通過激活棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(carnitine palmityl transferase 1，CPT1)與過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)，抑制乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP-1)與脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)來調(diào)控脂質(zhì)代謝[6-7]。綜合文獻(xiàn)分析，我們推測DHM可能通過激活SIRT1-AMPK通路抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3～4 周C57BL/6J雄鼠(60只)，體質(zhì)量 (17±1.5) g(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)，合格證號(hào)為： SCXK(湘)2020-0002。飼養(yǎng)于南華大學(xué)動(dòng)物房(3～5只每籠)，動(dòng)物房內(nèi)12 h明暗交替；將環(huán)境溫度設(shè)置為(23～24) ℃，并保證小鼠充足的飼料與飲用水，實(shí)驗(yàn)過程以美國國立衛(wèi)生研究院的《國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與管理?xiàng)l例》為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥品、試劑 Trizol試劑(G3013)及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(WG441-K1622)來自Servicebio公司；兔抗小鼠SREBP-1抗體(AF8055)、FAS抗體(AF6861)、ACC抗體(AF1867)、CPT1抗體(AF6558)、PPARα抗體(AF7794)、SIRT1抗體(AF5300)、AMPK抗體(AF1627)和β-actin抗體(AA128)購于Beyotime公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器 中國上海博迅實(shí)業(yè)公司的普通光學(xué)顯微鏡 (BM-139C)；美國Bio-Rad公司的熒光定量PCR儀(CFX384 Touch)；美國Bio-Rad公司的基礎(chǔ)電泳儀(1656001)與電泳槽/轉(zhuǎn)印槽(1703930)。

1.3 二氫楊梅素溶液的配制DHM購于張家界志誠生物科技有限公司。將雙蒸水置于70 ℃的恒溫水浴箱中加熱，20 min后，將一定量的DHM溶解在已經(jīng)加熱好的雙蒸水中，并用玻璃棒攪拌均勻，配置為50 g·L-1濃度的DHM溶液。

1.4 肥胖模型的建立和分組實(shí)驗(yàn)鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行隨機(jī)分組，采用正常飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)分別采取或不采取低、高劑量的DHM(125 mg·kg-1·d-1和250 mg·kg-1·d-1)灌胃處理16周。因此，實(shí)驗(yàn)共分成6組(n=10)： 正常對照組(ND組)、正常對照+低劑量二氫楊梅素組(ND+L-DHM組)、正常對照+高劑量二4氫楊梅素組(ND+H-DHM組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+低劑量二氫楊梅素組(HFD+L-DHM組)、高脂飲食+高劑量二氫楊梅素組(HFD+H-DHM組)。在此期間，每4周記錄1次小鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(16周末)，所有小鼠禁食處理后稱重，肥胖模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)為HFD小鼠體質(zhì)量超過ND小鼠體重的百分之二十或更多。

1.5 體脂和血脂的測量16周末，將小鼠禁食過夜，然后進(jìn)行稱重與眼眶靜脈取血，離心取上清液，采用生化分析儀測小鼠血脂(總膽固醇、甘油三酯與高密度脂蛋白)。由于肩胛下、附睪與腹股溝的脂肪體積大且易分離，占小鼠脂肪的大部分，可反應(yīng)小鼠體脂的變化。因此將小鼠脫頸椎處死后，取肩胛下、附睪與腹股溝的脂肪并用電子秤進(jìn)行稱重，并記錄脂肪重量。

1.6 肝臟蘇木精-伊紅染色取肝臟組織，切取一塊厚約5～7 mm，類似等邊三角形的肝臟組織， 4 ℃磷酸緩沖液沖洗組織后， 10%的甲醛溶液固定24 h，用自動(dòng)包埋機(jī)和輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)來包埋與切片，切片的厚度約為4 μm。最后通過自動(dòng)染色機(jī)用蘇木精與伊紅對標(biāo)本進(jìn)行染色后封片。于顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織石蠟切片染色結(jié)果并拍片。

1.7 肝臟油紅O染色將1.6步驟中切片的肝臟組織，用4%甲醛固定0.5 h后,用 0.3% 油紅O染液染色半小時(shí)，然后經(jīng)蘇木精復(fù)染0.5 min后，甘油封片，顯微鏡下觀察并拍攝。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測肝臟組織SIRT1、AMPK、參與脂質(zhì)生物合成的(SREBP1、FAS、ACC1)和參與脂質(zhì)分解的(PPARα、CPT1)的mRNA表達(dá)用TRIzol提取肝組織的總RNA。測定其純度及濃度，隨后將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。引物如Tab 1所示。Real-time PCR采用20 μL反應(yīng)體系，3個(gè)步驟:(i) 雙鏈DNA在95℃下分離，(ii)引物在58℃退火半分鐘,(iii)最后72 ℃延伸半分鐘, 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt計(jì)算每個(gè)基因的相對表達(dá)量。

Tab 1 Genes detected and their primers and fragment lengths

1.9 Western blot檢測肝臟組織SIRT1、AMPK、脂質(zhì)生物合成有關(guān)基因(SREBP1、FAS、ACC1)和脂質(zhì)分解代謝有關(guān)基因(PPARα、CPT1)的蛋白表達(dá)研磨肝臟組織、提取蛋白質(zhì)，測定濃度。取30μg蛋白進(jìn)行 SDS- PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入抗SIRT1、FAS、AMPK、ACC1、PPARα、SREBP1、CPT1抗體，抗體稀釋倍數(shù)為1 ∶1 000，4 ℃搖床過夜之后洗滌。然后放入二抗，室溫反應(yīng)2～4 h，充分洗滌后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行反應(yīng)。曝光后進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 DHM對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體質(zhì)量、體脂、血脂與肝臟脂肪蓄積的影響

2.1.1DHM可抑制高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠體質(zhì)量增加 如Fig 1 所示：與ND組相比，小鼠經(jīng)喂食高脂飼料16周后，體質(zhì)量增加，提示肥胖小鼠模型復(fù)制成功。DHM處理的HFD小鼠從第8周體質(zhì)量開始降低。提示DHM處理可使肥胖小鼠體質(zhì)量減少，但對正常小鼠的體質(zhì)量無明顯改變。

Fig 1 Body mass of c57bl/6j mice fed with high fat diet reduced by dihydromyricetin ( n=10)

2.1.2DHM可抑制高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠體脂重量增加 如Fig 2所示：相比ND組，HFD組體脂重量升高；高劑量或低劑量DHM能使HFD小鼠體脂重量下降；但與ND組相比，經(jīng)DHM處理的ND小鼠體脂重量卻無明顯變化。提示DHM能夠抑制HFD小鼠體脂重量升高，但對ND小鼠體脂重量無影響。

Fig 2 Body fat weight in obese mice induced by a high fat diet reduced by dihydromyricetin n=10)

2.1.3DHM對HFD小鼠血脂的影響 如Tab 2 所示： HFD組小鼠的血清TG、TC與HDL含量明顯比ND組高；經(jīng)高、低劑量處理的DHM小鼠血脂低于HFD組；但經(jīng)高劑量或低劑量DHM處理的ND小鼠與ND組之間的血脂水平無明顯差異。提示DHM可降低HFD小鼠的TC、TG和HDL，但對正常小鼠無明顯影響。

Tab 2 Effects of dihydromyricetin on blood lipid of obese mice induced by high fat diet n=10)

2.1.4DHM抑制高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積 HE與油紅O染色結(jié)果表明(Fig 3)：ND小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)無異常，肝臟細(xì)胞分布有序、大小均一、胞質(zhì)豐富，放射狀分布在中央靜脈周圍，無變性、壞死；而HFD小鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞腫大，呈氣泡狀，出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，細(xì)胞質(zhì)中富含大小不一的圓狀脂質(zhì)滴，細(xì)胞核受脂質(zhì)滴影響發(fā)生變性、偏移；HFD小鼠經(jīng)DHM處理后肝細(xì)胞脂滴狀況明顯改善，細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，肝臟細(xì)胞脂肪變性的面積及密度降低。但L-DHM與H-DHM對ND小鼠肝細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。提示：DHM可降低HFD小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積。

2.2 DHM抑制HFD小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積的機(jī)制

2.2.1DHM對HFD小鼠肝臟SIRT1和AMPK 基因與蛋白表達(dá)的影響 定量PCR(Fig 4A)和Western blot(Fig 4B)結(jié)果顯示，小鼠肝組織中mRNA和蛋白的表達(dá)量：相比ND組，HFD組小鼠SIRT1和AMPK量降低；而相比HFD組，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組小鼠SIRT1和AMPK量升高；但L-DHM與H-DHM對ND小鼠SIRT1和AMPK mRNA和蛋白表達(dá)無影響；提示DHM能夠增加HFD小鼠SIRT1和AMPK的基因及蛋白表達(dá)。

2.2.2DHM對HFD小鼠肝臟脂質(zhì)合成代謝有關(guān)因子(SREBP1、ACC1和FAS)mRNA及蛋白表達(dá)的影響 qRT-PCR(Fig 5A)和Western blot(Fig 5B)結(jié)果顯示小鼠肝組織中mRNA和蛋白的表達(dá)量：相比ND組，HFD組SREBP1、ACC1與FAS表達(dá)明顯升高，而相比HFD組，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組SREBP1、ACC1和FAS表達(dá)降低；但ND組、ND+L-DHM和ND+H-DHM 3組間SREBP1、ACC1和FAS mRNA和蛋白表達(dá)無明顯差異。提示DHM可能通過降低HFD小鼠肝臟中參與脂質(zhì)生物合成的SREBP1、ACC1和FAS 的表達(dá)改善其肝臟脂肪沉積。

Fig 3 Lipid deposition in liver of obese mice induced by high fat diet reduced by dihydromyricetin

Fig 4 Effects of dihydromyricetin on mRNA and protein expression of SIRT1 and AMPK in livers of obese mice induced by high fat diet n=4-5)

Fig 5 Effects of dihydromyricetin on mRNA and protein expression of SREBP1, ACC1 and FAS in livers of obese mice fed with high fat diet n=4-5)

2.2.3DHM對HFD小鼠肝臟脂質(zhì)分解有關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)的影響 qRT-PCR(Fig 6A)和Western blot(Fig 6B)結(jié)果顯示：相比ND組，HFD組參與肝臟脂質(zhì)分解的 PPARα和CPT1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，而相比HFD組，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM小鼠的肝臟中PPARα和CPT1 mRNA和蛋白表達(dá)升高。但ND組、ND+L-DHM和ND+H-DHM 3組間PPARα和CPT1 基因和蛋白表達(dá)無明顯差異。提示DHM可能通過增加HFD小鼠肝臟脂質(zhì)分解代謝有關(guān)因子(PPARα和CPT1)的表達(dá)改善其肝臟脂肪沉積。

Fig 6 Effects of dihydromyricetin on mRNA and protein expression of PPARα and CPT1 in livers of obese mice fed with high fat diet n=4-5)

3 討論

肥胖是一種由于能量攝入過多，造成體內(nèi)脂肪異常聚積的疾病，是當(dāng)今世界患病率增長最為迅速的代謝性疾病之一，其中將近80%的肥胖患者，都伴隨著程度不同的肝臟脂肪變性[8]。肝臟是機(jī)體代謝的重要器官，肥胖的發(fā)生發(fā)展與肝臟代謝失衡緊密相關(guān)，同時(shí)肥胖也是肝臟代謝失衡的重要原因。肥胖個(gè)體中過量的脂肪組織導(dǎo)致游離脂肪酸大大增加，從而使肝臟、胰腺β細(xì)胞等代謝組織內(nèi)脂質(zhì)含量增加，引起一些代謝性疾病。肥胖會(huì)通過增加肝細(xì)胞死亡率、增加活性氧生成、改變脂肪因子、細(xì)胞因子平衡等在肝臟形成促纖維脂增生，進(jìn)而促進(jìn)一系列肝臟代謝疾病發(fā)生發(fā)展[9]。雖然藥物治療是肝臟脂質(zhì)沉積患者的理想選擇，但目前仍未找到可長期使用且安全有效的藥物。因此，還需要尋找新的靶點(diǎn)研發(fā)新的藥物，解決肝臟脂質(zhì)沉積問題的道路仍然艱巨。

本課題組前期工作已經(jīng)證實(shí)：DHM能使高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠的體重與體脂下降，并對白色脂肪組織棕色化起正性作用[10]。也有相關(guān)文獻(xiàn)表明：高脂飲食是誘導(dǎo)肥胖、肝細(xì)胞脂肪變性、胰島素抵抗等代謝性疾病的重要因子[1]。那么，高脂飲食是否能影響肝臟脂質(zhì)沉積呢？本研究結(jié)果表明：高脂飲食的小鼠體重、體脂、血清總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白增加，肝細(xì)胞腫大、呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性、細(xì)胞質(zhì)中富含大小不一的圓形脂質(zhì)滴、肝臟細(xì)胞呈氣泡狀，肝臟內(nèi)脂質(zhì)生物合成有關(guān)基因的表達(dá)增加、脂質(zhì)分解有關(guān)基因表達(dá)降低，提示：高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積。

DHM是藤茶中最豐富的天然類黃酮類化合物，具有保護(hù)心臟、保護(hù)肝臟、改善糖尿病、抑制腫瘤等廣泛的藥理作用，具體機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)炎癥與氧化應(yīng)激[11]；DHM也可降低血清總膽固醇和甘油三酯水平，并增加高脂血癥大鼠的高密度脂蛋白水平[12]，那么，DHM能否改善高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積？本研究發(fā)現(xiàn)，DHM能使HFD小鼠體質(zhì)量、體脂、血清總膽固醇、甘油三酯與高密度脂蛋白水平發(fā)生明顯下降，且DHM能減輕肥胖小鼠肝臟彌漫性脂肪變性、減少胞質(zhì)中的圓形脂滴，提示：DHM可改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，其具體機(jī)制是什么呢？

SIRT1和AMPK是兩種重要的能量傳感器。去乙?；?(Sirtuin1, SIRT1)是一類蛋白脫乙酰酶，具有NAD+依賴性，是動(dòng)物代謝平衡過程中的關(guān)鍵傳感器[13]。SIRT1是肝臟代謝的重要調(diào)控因子，可以在肝臟糖異生、白色脂肪組織棕色化和胰島素分泌等過程中發(fā)揮作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是以絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶形式存在的細(xì)胞能量傳感器，在維持機(jī)體代謝平衡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AMPK的激活能夠增加分解代謝并降低ACC、FAS、SREBP等脂質(zhì)合成有關(guān)因子的表達(dá)水平，降低合成代謝的速率，調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成及利用[14]。SIRT1通過LKB1依賴方式介導(dǎo)AMPK的作用，進(jìn)一步控制下游脂質(zhì)調(diào)控因子[15]。SIRT1的過量表達(dá)還能增強(qiáng)機(jī)體的AMPK及ACC的磷酸化，進(jìn)一步抑制高糖誘導(dǎo)的FAS升高及血脂積聚[16]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，DHM能夠通過FLCN/FNIP1/AMPK途徑改善胰島素抵抗和阻止肥胖誘導(dǎo)的慢性肌纖維減少[17]。研究表明AMPK能夠通過激活CPT1和PPARα調(diào)控脂質(zhì)分解過程。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，過氧化物酶體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這兩種重要的代謝途徑可能會(huì)由于CPT1的降低而增強(qiáng)。脂質(zhì)最初生成由ACC、FAS及SCD先后作用，產(chǎn)生脂酰輔酶 A，脂酰輔酶 A經(jīng)過進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化形成脂肪酸，并以TG的形式存貯在肝臟中。PPARα則通過促進(jìn)線粒體及許多過氧化物酶體對脂肪酸的氧化過程來調(diào)控肝臟脂質(zhì)分解[18]。

本研究結(jié)果表明：DHM處理的肥胖小鼠肝臟中SIRT1、AMPK及PPARα和CPT1 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而SREBP1、FAS和ACC1則明顯減弱。提示，DHM可能通過激活SIRT1-AMPK通路，進(jìn)而抑制脂質(zhì)合成、促進(jìn)脂質(zhì)分解，達(dá)到改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪蓄積的目的。