急性高原病的動物模型研究現(xiàn)狀

霍 妍，趙安鵬，李 雪，李加忠，王 榮

(1. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000; 2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

地理學(xué)所說的高原一般指海拔大于500 m的地區(qū)，在醫(yī)學(xué)上，把海拔大于2 500 m的地區(qū)稱作高原。我國海拔大于2 500 m的地區(qū)超過國土面積的四分之一，是世界上高原面積最廣的國家。與平原相比，高原環(huán)境具有氣壓低、氧分壓低、寒冷、紫外線強(qiáng)、氣候干燥等特點(diǎn)。其中，低氧對機(jī)體的功能和代謝產(chǎn)生廣泛的、非特異性的影響，是高原環(huán)境影響人體的最重要因素。

人體在短時(shí)間內(nèi)由低海拔地區(qū)急進(jìn)高海拔地區(qū)時(shí)，由于不適應(yīng)高原環(huán)境所導(dǎo)致的各種病理生理反應(yīng)稱為急性高原病。急性高原病分為3種：急性高原反應(yīng)(acute mountain sickness，AMS)、高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)和高原腦水腫(high altitude cerebral edema，HACE)。AMS是輕微的、自限性的急性高原病，在急進(jìn)高原的人群中較為常見，癥狀一般在急進(jìn)數(shù)天后減輕或消失[1]。HAPE和HACE是嚴(yán)重的急性高原病，發(fā)病率低，致死率高，一般無法自愈。

隨著西北經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和“一帶一路”建設(shè)，越來越多的旅游及高原作業(yè)人群從平原進(jìn)入高原地區(qū)，急性高原病常常威脅著這些人的活動能力，甚至是生命健康。目前對于急性高原病的預(yù)防和治療沒有特效藥物，常用藥物也是療效甚微，緩解急性高原病的方法依然是吸氧和降低海拔，但這并不能從根本上解決急進(jìn)高原人群作業(yè)能力下降等問題。因此，開展急性高原病有效防治藥物的研究非常必要。而這些研究的基礎(chǔ)就是建立復(fù)現(xiàn)性好、評價(jià)體系健全的急性高原病動物模型。目前，常用的建模方法大多為采用一定的手段模擬高原低氧環(huán)境，使動物發(fā)生急性高原病癥狀。本文將從建模環(huán)境、建模方法和評價(jià)指標(biāo)等幾個(gè)方面綜述近年來研究中建立應(yīng)用的急性高原病的模型，以期為建立更好的急性高原病動物模型，深入研究急性高原病的病防治藥物及發(fā)病機(jī)制的提供基礎(chǔ)。

1 急性高原病簡介

1.1 急性高原反應(yīng)AMS常在急進(jìn)至海拔大于2 500 m的高原數(shù)小時(shí)后出現(xiàn)，表現(xiàn)為頭痛、厭食癥、惡心、嘔吐、頭暈、疲勞和睡眠障礙等，少數(shù)患者會發(fā)展為HACE，出現(xiàn)意識水平的改變和共濟(jì)失調(diào)[2]。急性高原反應(yīng)的發(fā)病率與海拔有密切的關(guān)系。在急進(jìn)至海拔2 500 m的人群中，有10%～25%的人發(fā)生AMS，癥狀通常很輕微，對活動幾乎沒有影響。然而，在海拔4 500～5 500 m的急進(jìn)人群中，有50%～85%會發(fā)生AMS，并可能影響活動能力。AMS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，是一種多因素的疾病。急進(jìn)高原后，低氧條件會促使機(jī)體會做出反應(yīng)，首先就是肺通氣量增加、呼吸頻率加快，其次會使腦血管擴(kuò)張，顱內(nèi)壓升高。急性低氧條件還會導(dǎo)致副交感神經(jīng)活動降低、交感神經(jīng)活動增強(qiáng)，自主神經(jīng)系統(tǒng)功能抑制，造成心率、血壓的改變以及胃腸功能的改變[3-4]。低氧導(dǎo)致的一系列生理變化均是導(dǎo)致AMS的因素。目前用來診斷AMS的方法較為主觀，一般用Acute Mountain Sickness-Cerebral評分(AMS-C)和Lake Louise評分(LLS)來判斷是否出現(xiàn)AMS，AMS-C≥0.7或LLS≥3并伴有頭痛，則表明AMS的發(fā)生[5]。

1.2 高原肺水腫高原肺水腫(HAPE)是急進(jìn)高海拔地區(qū)時(shí)發(fā)生的一種非心源性肺水腫，低氧和勞動被確定為HAPE發(fā)生的兩個(gè)主要因素，其發(fā)病率約為1%～2%，多見于海拔大于3 000 m的地區(qū)。HAPE起病急，發(fā)病快，其癥狀表現(xiàn)為體力喪失、呼吸困難、肺部濕性啰音、發(fā)紺、咳嗽、粉紅泡沫痰等[6]。HAPE的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要由毛細(xì)血管應(yīng)力衰竭導(dǎo)致，即低氧性肺血管收縮導(dǎo)致肺毛細(xì)血管動脈壓不均勻增加，其主要原因可能是丘腦交感神經(jīng)中樞興奮以及Ca2+通道激活等[7]。HAPE患者基礎(chǔ)肺動脈壓升高，心率升高[8]，胸片和CT掃描顯示分布于周圍的斑片狀水腫，并伴有炎癥反應(yīng)。

1.3 高原腦水腫高原腦水腫(HACE)一般出現(xiàn)在大于3 000 m的地區(qū)，發(fā)病率較低，致死率高。HACE被認(rèn)為是AMS的最終階段，其癥狀多表現(xiàn)為頭痛、惡心、嘔吐、意識混亂、共濟(jì)失調(diào)、昏迷等[2]。AMS向HACE轉(zhuǎn)化的原因尚不明確，可能是由于血腦屏障破壞、細(xì)胞內(nèi)水腫、靜脈回流障礙等[9]，有血管源性水腫和細(xì)胞毒性水腫共同存在的可能性[10]。HACE患者的腦部CT和核磁均顯示水腫并伴有多個(gè)微出血病灶[11]。

2 急性高原病研究模型

急性高原病動物模型建立的關(guān)鍵在于建立高原的低氧環(huán)境，主要方法有在高原環(huán)境模擬艙內(nèi)模擬高原低氧環(huán)境，建立動物模型，或直接在高原實(shí)地建立動物模型。

2.1 建模環(huán)境

2.1.1高原環(huán)境模擬艙動物模型 建立高原環(huán)境模擬艙動物模型即將動物飼養(yǎng)于模擬艙中，以降低艙內(nèi)氣壓的方式將模擬艙模擬海拔升至所需的高度，氧氣含量、二氧化碳含量、溫度、濕度、光照時(shí)間等均可設(shè)定，持續(xù)一定的天數(shù)。

低壓低氧是造成高原疾病的最主要因素，模擬艙可以模擬高原的低氧條件，因此急性高原病的動物模型可在模擬艙中建立。實(shí)驗(yàn)動物高原環(huán)境模擬艙分為大型實(shí)驗(yàn)動物模擬艙和小型實(shí)驗(yàn)動物模擬艙。大型高原環(huán)境模擬艙分為飼養(yǎng)艙和實(shí)驗(yàn)艙，飼養(yǎng)室可以設(shè)置相對較高的海拔(> 4 000 m)用于動物造模，而當(dāng)實(shí)驗(yàn)者需要對動物進(jìn)行給藥、取血等處置時(shí)，人員先進(jìn)入實(shí)驗(yàn)艙，考慮到安全或作業(yè)能力的因素，實(shí)驗(yàn)艙相對海拔較低(3 000～3 500 m)，待飼養(yǎng)艙海拔高度降至實(shí)驗(yàn)艙高度后，兩艙可相通進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在大型實(shí)驗(yàn)動物模擬艙中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可避免實(shí)驗(yàn)中直接將模擬海拔降至當(dāng)?shù)睾０魏?，富氧條件對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，目前廣泛應(yīng)用于急性高原病動物模型的建立。小型實(shí)驗(yàn)動物模擬艙亦可以將動物置于相應(yīng)海拔飼養(yǎng)，但實(shí)驗(yàn)中可控制的環(huán)境因素較少，且對動物進(jìn)行處置時(shí)，也只能將動物從艙中取出，置于當(dāng)?shù)睾０芜M(jìn)行操作。但是，這類設(shè)備使用方便、操作簡單、成本低，常用于實(shí)驗(yàn)中途不需對動物進(jìn)行處置的實(shí)驗(yàn)。

高原環(huán)境模擬艙可以在平原地區(qū)使用，不需實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)動物和實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)入高原地區(qū)，避免長途運(yùn)輸，較為省時(shí)省力，并且模擬艙海拔高度可以自由設(shè)定，可以在同一地區(qū)模擬不同海拔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此外，模擬倉的海拔升降速度、溫度、濕度等環(huán)境因素可控，避免了因地區(qū)、季節(jié)、運(yùn)輸方式等因素的變化影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，便于實(shí)驗(yàn)條件的復(fù)現(xiàn)，目前廣泛應(yīng)用于急性高原病動物模型的建立。

但是，在急性高原病的實(shí)驗(yàn)研究中，常需在實(shí)驗(yàn)中途對動物進(jìn)行處置，即使在大型模擬艙內(nèi)，對動物進(jìn)行處置時(shí)也需將飼養(yǎng)艙模擬海拔降至不影響人類活動的高度，這便不能保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動物始終處于穩(wěn)定的海拔。

2.1.2高原實(shí)地動物模型 高原實(shí)地動物模型的建立方法為將動物由平原急進(jìn)高原或由低海拔高原急進(jìn)至高海拔高原，飼養(yǎng)一定的天數(shù)。

高原疾病主要由高原的低氧環(huán)境所致，但是在高原實(shí)地建立動物模型時(shí)，難以避免由于氣候、季節(jié)、急進(jìn)方式等因素引起的誤差，在高原實(shí)地建立動物模型的方法尚不常用。因此，在高原環(huán)境下建立SPF級動物實(shí)驗(yàn)室以及完善實(shí)驗(yàn)動物急進(jìn)高原的流程對于在高原實(shí)地建立急性高原病動物模型十分重要，現(xiàn)于我國青海玉樹已經(jīng)建立有全軍高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。目前，雖然在高原實(shí)地實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立的急性高原疾病動物模型較少，但已經(jīng)開展了多項(xiàng)高原藥物代謝動力學(xué)的實(shí)驗(yàn)，并取得重大進(jìn)展。例如，王昌等[12]發(fā)現(xiàn)，大鼠由上海(海拔55 m)急進(jìn)至青海瑪多(海拔4 300 m)后，左氧氟沙星在大鼠體內(nèi)代謝過程發(fā)生明顯變化；李文斌[13]使大鼠由上海(海拔55 m)急進(jìn)至甘肅瑪曲高原(海拔4 010 m)，發(fā)現(xiàn)在高原條件下，普萘洛爾的藥代動力學(xué)參數(shù)發(fā)生了顯著變化。

高原實(shí)地實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皬V泛應(yīng)用于高原藥物代謝動力學(xué)的研究，有望應(yīng)用于急性高原病動物模型的建立。也可以應(yīng)用于慢性高原病的研究，并且可以開展人體的高原藥物代謝動力學(xué)研究。

2.2 建模方法

2.2.1單純飼養(yǎng) 單純飼養(yǎng)建立動物模型時(shí)所需的海拔較高，常在模擬艙中進(jìn)行，一般將飼養(yǎng)艙模擬海拔設(shè)置在6 000～8 000 m，天數(shù)不等。需要對動物處置時(shí)，模擬海拔一般為3 000～4 000 m，防止海拔過高對實(shí)驗(yàn)人員造成傷害，或過低對所建模型產(chǎn)生影響。Yu等[14]將大鼠暴露在模擬海拔8 000 m的氧艙內(nèi)，24 h后其腦含水量升高，并發(fā)現(xiàn)提前給藥銀杏內(nèi)酯B能夠顯著降低腦含水量，有潛在的預(yù)防HACE的作用(Tab 1)。Huang等[15]在模擬6 000 m海拔的模擬艙內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠的腦含水量升高、血腦屏障通透性升高、腦組織切片顯示組織損傷、水迷宮試驗(yàn)中逃脫潛伏期增長，提示小鼠發(fā)生高原腦水腫。Wang等[16]在模擬6 000 m海拔下，測得大鼠缺氧48 h后，腦含水量升高、血清內(nèi)TNF-α、IL-6水平上升、腦組織切片顯示組織損傷、水迷宮試驗(yàn)中逃脫潛伏期增長，指示高原腦水腫的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)給藥乙酰唑胺以及葛根素能夠明顯改善上述指標(biāo)。Lee等[17]在模擬海拔8 000 m的減壓室內(nèi)使大鼠暴露9 h，測得大鼠肺含水量升高、肺泡灌洗液內(nèi)出現(xiàn)蛋白滲漏、肺組織有明顯損傷，證明出現(xiàn)高原肺水腫，預(yù)防給藥紅景天提取物可以緩解急性缺氧導(dǎo)致的上述指標(biāo)的改變。

Tab 1 Modeling of animal model of acute plateau disease

2.2.2跑臺力竭運(yùn)動 在高原條件下，單純飼養(yǎng)建立急性高原病動物模型在目前的研究中應(yīng)用十分普遍，但單純飼養(yǎng)所建立的HAPE動物模型成功率低、表征不明顯，且復(fù)現(xiàn)性不良。因此，使實(shí)驗(yàn)動物在低壓、低氧環(huán)境中進(jìn)行力竭運(yùn)動來建立HAPE動物模型的方法被廣泛應(yīng)用。其次，高原條件下的力竭運(yùn)動能夠類比人類在高原地區(qū)的登山、勞作等活動，使該模型的建立更加契合人類急性高原病的發(fā)生過程。力竭運(yùn)動模型的建立所需海拔較低，表征更明顯。Sheppard等[18]在驗(yàn)證運(yùn)動是否會增加HAPE的發(fā)病率的實(shí)驗(yàn)中，比較了常氧、常氧運(yùn)動、低氧、低氧運(yùn)動對大鼠肺含水量、肺通透性、肺組織形態(tài)產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示常氧和常氧運(yùn)動組未出現(xiàn)明顯差異，證明常氧條件下的運(yùn)動不會導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生。

建立跑臺力竭運(yùn)動動物模型，一般在4 000～6 000 m的海拔下，時(shí)間多為48 h，使用實(shí)驗(yàn)動物跑臺讓動物進(jìn)行連續(xù)運(yùn)動，在3 000～4 000 m海拔下對動物進(jìn)行處置。Zhou等[19]使大鼠在4 500 m的模擬海拔下進(jìn)行力竭運(yùn)動，之后將海拔升至6 000 m處，48 h后測得肺含水量上升、肺泡灌洗液蛋白含量升高、血清內(nèi)細(xì)胞因子TNF、IL-1b、IL-6、IL-8水平上升，切片檢查可見肺組織損傷，電鏡顯示超微結(jié)構(gòu)被破壞，指示有高原肺水腫發(fā)生，給藥地塞米松或索那肽后，上述損傷能夠得到有效緩解。She等[20]使小鼠在5 000 m的模擬海拔下進(jìn)行力竭訓(xùn)練，48 h后測得肺含水量升高、肺泡灌洗液有細(xì)胞和蛋白滲漏，組織學(xué)分析可見明顯損傷，提示小鼠發(fā)生HAPE；并發(fā)現(xiàn)大鼠在模擬海拔4 700 m進(jìn)行力竭訓(xùn)練后，肺泡毛細(xì)血管滲透率也會升高，進(jìn)一步驗(yàn)證HAPE的發(fā)生，并證明了角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2 可以緩解低氧運(yùn)動造成的肺部損傷，有潛在的治療HAPE的作用[21]。

目前對于HAPE的研究中，通過跑臺力竭運(yùn)動來建立動物模型的方法使用最多，成功率最高，復(fù)現(xiàn)性最好，并且方便可行。建立跑臺力竭運(yùn)動動物模型所需的海拔相對較低，在模擬艙和高原實(shí)地均有實(shí)施的可能性。

3 模型評價(jià)指標(biāo)

3.1 AMS臨床上AMS的診斷方法為詢問患者的主觀感受，但是在動物實(shí)驗(yàn)中難以準(zhǔn)確獲得動物的主觀感受，目前并沒有準(zhǔn)確的指示實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生AMS的辦法。在出現(xiàn)AMS的癥狀時(shí)，高原低氧會導(dǎo)致動物血?dú)饧把Ｒ?guī)異常、血清生化指標(biāo)異常、氧化應(yīng)激損傷和炎癥現(xiàn)象[22-24]等，現(xiàn)有研究中一般以這些指標(biāo)來評價(jià)低氧損傷的程度，間接反映AMS的發(fā)生。但到目前為止，并沒有明確的評價(jià)指標(biāo)證實(shí)AMS動物模型建立成功。

動物急性暴露于高原低氧條件后，可發(fā)現(xiàn)動脈血?dú)獾母淖?，主要表現(xiàn)為pH降低、血氧飽和度下降等；血常規(guī)檢測中可見白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白含量異常等；機(jī)體主要組織器官出現(xiàn)輕微或明顯的損傷，氧化應(yīng)激指標(biāo)發(fā)生改變；血清中生化指標(biāo)改變，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量上升，指示伴隨炎癥反應(yīng)發(fā)生[25](Tab 2)。但低氧損傷并不等同于出現(xiàn)AMS，AMS動物模型的建立方法有待進(jìn)一步確立。

3.2 HAPE發(fā)生HAPE的動物中除了可以檢測出上述AMS模型檢測指標(biāo)的變化外，還可檢測出肺含水量升高，肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白和白蛋白含量上升且存在細(xì)胞滲漏，肺泡毛細(xì)管滲透率升高，組織切片可見肺血管充血、肺泡間隔增厚、肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞和粉紅色蛋白物質(zhì)?，F(xiàn)有模型中多以上述指標(biāo)的變化來表示HAPE的發(fā)生，但與臨床診斷指標(biāo)并不完全匹配，可增加小動物肺部CT來證明HAPE發(fā)生。

3.3 HACE出現(xiàn)HACE的動物也可以檢測出AMS模型檢測指標(biāo)的變化，另外還會出現(xiàn)腦含水量升高，血腦屏障通透性升高，組織切片可見細(xì)胞間隙明顯擴(kuò)大、皮質(zhì)血管擴(kuò)張、神經(jīng)元萎縮、細(xì)胞核呈暗色固縮，水迷宮試驗(yàn)逃脫潛伏期增長等。小動物腦部CT可用于診斷HACE，但現(xiàn)有研究中鮮有使用。

4 結(jié)語

我國高原面積廣大，由于各種原因需要進(jìn)入高原的人數(shù)也日益增多，進(jìn)行急性高原病的防治研究和基礎(chǔ)研究都十分重要。急性高原病包括急性高原反應(yīng)、高原肺水腫、高原腦水腫，海拔高度、上升速率、個(gè)體易感性都會影響發(fā)病率及嚴(yán)重程度[26-27]。AMS的發(fā)病率較高，但癥狀較輕微，典型癥狀為頭痛，一般不影響活動，多用紅景天或乙酰唑胺預(yù)防[28-29]。大多在急進(jìn)高原后數(shù)天可適應(yīng)，或在降低海拔后自愈，少數(shù)會發(fā)展為更加嚴(yán)重的HACE。急進(jìn)高原并伴有劇烈運(yùn)動時(shí)，易發(fā)生HAPE，HAPE發(fā)病率低，但起病急，發(fā)病快，多見于海拔3 000 m以上地區(qū)，CT檢查可見肺部病變，現(xiàn)臨床多以降低海拔配合硝苯地平治療HAPE。HACE被認(rèn)為是AMS的最終階段，發(fā)病率低，致死率高，見于海拔3 000 m以上地區(qū)，CT檢查可見腦部病變，降低海拔加以地塞米松可緩解其癥狀[30]。

Tab 2 Evaluation index of animal model of acute plateau disease

目前對于急性高原病的治療都是以降低海拔、吸氧并輔以藥物治療的方法，單純使用藥物進(jìn)行預(yù)防或治療效果甚微，這給急進(jìn)高原人群帶來了很大的不變，因此急需開發(fā)針對急性高原病的特效藥物。急性高原病主要由高原低壓低氧環(huán)境所誘導(dǎo)，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，對于急性高原病的基礎(chǔ)研究也有待深入。雖然現(xiàn)已有不少成功建立出HAPE和HACE動物模型的案例，但大多指向性不強(qiáng)、復(fù)現(xiàn)性不好，對于AMS的動物模型的建立也尚未有結(jié)果，這給急性高原病的深入研究帶來很多困難。

雖然在現(xiàn)有研究中，有不少急性高原病動物模型建立并應(yīng)用于研究中，但仍有一些問題有待深入研究，例如(1)AMS動物模型沒有明確的評價(jià)指標(biāo)；(2)HAPE和HACE的臨床診斷多用CT，而在建立動物模型時(shí)并未用CT證明疾病的發(fā)生，與臨床診斷方法不完全匹配；(3)現(xiàn)有急性高原病動物模型多在高原環(huán)境模擬艙建立，高原地區(qū)SPF級實(shí)驗(yàn)室少，在實(shí)地建立的案例很少，實(shí)地力竭運(yùn)動的動物模型有待建立。