肝細胞癌患者肝動脈化療栓塞術(shù)后外周血長鏈非編碼RNA TINCR水平與Th1/Th2平衡及預后的相關(guān)性分析

柏 濤，王靜麗，胡旭東，夏 冰，程海林，王 娟

武漢市金銀潭醫(yī)院 a.消化科，b.肝病科，c.感染科，武漢 430023

由于肝細胞癌(HCC)缺少特異性的早期癥狀，患者臨床確診時大多處于中晚期，無法進行根治性手術(shù)，患者5年生存率不足5%[1]。近年來，隨著現(xiàn)代影像設備的不斷發(fā)展以及微創(chuàng)技術(shù)水平的不斷提高，在大型設備數(shù)字減影機的應用下，對于無法進行手術(shù)根治的HCC患者行肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)成為主要治療方式[2]。TACE介入治療可有效減少、阻斷腫瘤血供，從而導致腫瘤缺血、缺氧而壞死[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類缺乏開放閱讀框、長度>200個核苷酸的非編碼RNA。近年研究[4]顯示，lncRNA參與了機體各種生理以及病理過程，同時在腫瘤細胞增殖、遷移等過程中作為抑癌基因或致癌基因發(fā)揮相應的正反饋調(diào)節(jié)作用或負反饋調(diào)節(jié)作用。lncRNA TINCR是一種非典型lncRNA，其在體細胞組織分化以及腫瘤進程中均具有重要作用[5]。本研究探討分析HCC外周血lncRNA TINCR表達水平與TACE術(shù)后輔助性T淋巴細胞1(Th1)/Th2平衡及預后相關(guān)性，為進一步揭示HCC介入治療的預后情況提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2015年3月—2017年3月本院行TACE治療的HCC患者。隨機抽取在本院體檢的健康志愿者作為對照組。納入標準：(1)治療前經(jīng)超聲、CT或2種以上影像學檢查確診為HCC；(2)經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性肝癌；(3)凝血功能正常；(4)介入治療術(shù)前未接受放療或化療治療；(5)預計生存期>3個月；(6)TNM分期 Ⅱ～Ⅲ 期；(7)患者自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)腹水中至大量；(2)合并其他惡性腫瘤患者；(3)合并嚴重心腦血管疾病患者；(4)合并精神疾病患者；(5)哺乳期或妊娠期女性；(6)TACE治療后1個月內(nèi)并發(fā)嚴重感染患者；(7)合并自身免疫性疾病或免疫缺陷性疾病患者；(8)有TACE治療禁忌證患者。

1.2 方法

1.2.1 TACE治療方案 患者接受局部麻醉后，采用Seldinger穿刺法，經(jīng)皮股動脈穿刺插管，將導管插入腫瘤供血動脈內(nèi)，隨后注入造影劑，進行肝動脈造影，仔細觀察患者腫瘤位置、腫瘤大小以及供血情況。隨后依次注入5-氟尿嘧啶(1000～12 000 mg)、比柔多星(40～60 mg)進行栓塞化療，使用碘化油作為栓塞劑，部分患者可使用明膠海綿進行栓塞，術(shù)后給予患者抑酸、保肝、水化支持以及抗菌藥物等治療。TACE治療每4周1次，每例患者最多進行3次。

1.2.2 外周血lncRNA TINCR表達檢測 于TACE完成后7 d抽取患者清晨空腹外周靜脈血，對照組受試者于體檢當日抽取清晨空腹外周靜脈血。室溫下靜置15～30 min，離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，小心吸取上清液置于試管內(nèi)，再次離心10 min(2500 r/min，4 ℃)，留取上清后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。取上述血漿樣本，每份400 μl，采用Qiagen miRNeasy Serun/Plasma kit試劑盒使用說明書提取血漿內(nèi)總RNA，并使用紫外分光光度計測量總RNA濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，使用real-time PCR檢測血漿中l(wèi)ncRNA TINCR相對表達量，TINCR上游引物5′-CCATCCCTCTGTAACCACCT-3′，下游引物5′-GTTGGGTCTAGATTCCAGCA-3′；使用Actin作為內(nèi)參基因，Actin上游引物5′-ATCATGTTTGCCTAGATCAACA-3′，下游引物5′-GATCTCTTGCTAAGCGTCCA-3′。引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成。real-time PCR反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用2-△△CT法表示lncRNA TINCR相對表達量。

1.2.3 Th1/Th2細胞因子檢測 HCC組患者于TACE完成后7 d抽取患者清晨空腹外周靜脈血，對照組受試者于體檢當日抽取清晨空腹外周靜脈血，離心15 min(3500 r/min，4 ℃)，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清IFNγ、IL-2、IL-4以及IL-10水平，檢測試劑盒購于美國R&D公司，檢測嚴格參照試劑盒使用說明書進行。

1.2.4 術(shù)后隨訪 TACE術(shù)后對患者進行隨訪，隨訪方式包括門診隨訪、電話隨訪等，隨訪截止日期為2019年8月1日，以患者死亡作為隨訪終點事件。

1.3 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由湖北省武漢市金銀潭醫(yī)院倫理委員會審批，批號：倫審2017-02A。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入HCC患者85例，其中男46例、女39例，年齡29～76歲，平均(55.72±14.29)歲；Child-Pugh分級A級26例、B級53例、C級6例；血管侵犯64例；腫瘤大小>5 cm 51例、≤5 cm 34例；臨床分期Ⅱ期44例、Ⅲ期41例。另選取對照組30例，其中男17例、女13例，年齡30～75歲，平均(54.28±15.20)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

2.2 外周血lncRNA TINCR相對表達量比較 HCC組患者外周血lncRN TINCR相對表達量(1.784±0.429)高于對照組(0.926±0.263)，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.277，P<0.05)。

2.3 lncRNA TINCR相對表達量與HCC患者病理特征分析 lncRNA TINCR相對表達與HCC患者血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤分期及血清AFP水平有關(guān)(t值分別為3.958、4.499、3.361、4.949，P值均<0.05)(表1)。

表1 lncRNA TINCR相對表達量與HCC患者病理特征分析

2.4 Th1/Th2細胞因子表達水平比較 HCC組患者血清IFNγ、IL-2水平明顯低于對照組(t值分別為11.408、6.986，P值均<0.05)，而IL-4、IL-10水平明顯高于對照組(t值分別為6.426、6.909，P值均<0.05)(表2)。

表2 兩組受試者Th1/Th2細胞因子水平比較

2.5 HCC患者lncRNA TINCR相對表達量與Th1/Th2細胞因子的相關(guān)性分析 HCC患者外周血lncRNA TINCR相對表達量與血清IFNγ、IL-2水平呈負相關(guān)(r值分別為-3.164、-3.270，P值均<0.001)，與患者血清IL-4、IL-10呈正相關(guān)(r值分別為2.963、3.044，P值分別為0.007、<0.001)。

2.6 lncRNA TINCR相對表達量與患者預后關(guān)系 以lncRNA TINCR相對表達量≥1.700作為高表達，85例HCC患者中l(wèi)ncRNA TINCR高表達患者47例，低表達患者38例。log-rank檢驗結(jié)果顯示，lncRNA TINCR低表達患者生存情況明顯優(yōu)于高表達患者(χ2=4.182,P<0.05)(圖1)。

圖1 lncRNA TINCR相對表達量與患者預后關(guān)系

3 討論

HCC血供75%～80%均來自于肝動脈，TACE介入治療可有效阻斷HCC供血動脈，導致腫瘤組織缺血、缺氧而發(fā)生壞死，尤其對于中晚期HCC患者而言，由于癌細胞發(fā)生擴散，多合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移，TACE是目前首選治療方案，但患者5年生存率仍然較低[6-7]。lncRNA目前已被證實在人體染色體重組、修飾過程中具有著重要的調(diào)控作用，可誘導組蛋白修飾，進行RNA選擇性剪切，在基因啟動子干擾以及蛋白質(zhì)活性中發(fā)揮著重要作用，同時可作為腫瘤生物標志物，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的診斷方面有重要價值[8-9]。研究[10]顯示，TINCR在膀胱癌組織中表達上調(diào)，促進了膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展，此外，抑制TINCR表達可抑制腫瘤細胞增殖而促進細胞體外凋亡，認為TINCR是膀胱癌治療的潛在靶點。同時，研究[11]顯示，在HCC組織中可出現(xiàn)TINCR的異常表達，并認為該種異常表達與患者臨床病理特征有密切關(guān)系。

本研究選取TACE治療的HCC患者作為研究對象，分析患者外周血lncRNA TINCR表達情況及其與患者術(shù)后Th1/Th2平衡和預后相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比較，HCC患者TACE術(shù)后仍存在lncRNA TINCR的高表達，且表達情況與患者血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤分期及血清AFP水平有關(guān)，與相關(guān)研究[12-13]結(jié)果一致，提示HCC患者的lncRNA TINCR高表達與HCC的疾病進展程度有關(guān)，進一步證實了lncRNA TINCR與HCC的發(fā)生發(fā)展具有著密切的聯(lián)系。

T淋巴細胞所介導的細胞免疫在機體排斥腫瘤過程中發(fā)揮著重要作用，Th1/Th2極化作為機體免疫應答的重要環(huán)節(jié)，對腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要影響[14-15]。Th1細胞可分泌IFNγ、IL-2等細胞因子，參與抗腫瘤細胞免疫過程；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，參與體液免疫過程，同時具有抗Th細胞作用[16]。在正常機體內(nèi)，Th1/Th2細胞處于平衡狀態(tài)，在惡性腫瘤患者中表現(xiàn)為Th1/Th2平衡破壞，出現(xiàn)Th1/Th2漂移。本研究結(jié)果顯示，HCC組患者血清IFNγ、IL-2水平明顯低于對照組，而IL-4、IL-10水平明顯高于對照組，提示與健康人群相比較，HCC患者表現(xiàn)為Th1細胞功能減弱以及Th2細胞功能升高，患者Th1/Th2細胞平衡以Th2作為優(yōu)勢細胞，與相關(guān)研究[17-18]結(jié)果一致，這種免疫功能的改變被認為可能與腫瘤的發(fā)展有密切聯(lián)系。

分析患者lncRNA TINCR表達與Th1/Th2細胞平衡之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HCC患者外周血lncRNA TINCR相對表達量與患者血清IFNγ、IL-2呈負相關(guān)，與患者血清IL-4、IL-10呈正相關(guān)，提示lncRNA TINCR與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，可能是TINCR調(diào)控腫瘤進展的機制之一[19-20]，但仍需要進行進一步的研究證實。此外，分析lncRNA TINCR表達對患者TACE治療后生存情況的影響，結(jié)果顯示，lncRNA TINCR低表達患者生存情況顯著優(yōu)于高表達患者，提示lncRNA TINCR與HCC患者治療預后密切相關(guān)，可作為患者預后預測的潛在指標[21]。關(guān)于lncRNA TINCR對HCC的影響，可能考慮lncRNA TINCR對患者機體免疫功能的調(diào)控，但是關(guān)于其具體的分子機制尚未闡明。

綜上所述，HCC血管介入治療患者術(shù)后外周血lncRNA TINCR表達明顯高于健康人群，而lncRNA TINCR表達與患者病理特征及Th1/Th2免疫平衡有密切聯(lián)系，可作為患者生存預后的潛在預測指標之一，值得進一步深入研究分析。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：柏濤、王靜麗負責課題設計，資料分析，撰寫論文；夏冰、程海林、王娟參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；胡旭東負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。