兒童慢性乙型肝炎肝組織HBsAg、HBcAg的表達(dá)與抗病毒療效的關(guān)系

王麗旻 , 劉樹(shù)紅, 朱世殊, 董 漪, 徐志強(qiáng), 王福川, 閆建國(guó), 王 璞,李愛(ài)芹, 曹麗麗, 趙 攀, 張 敏

解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 a.肝病學(xué)部，b.感染學(xué)部, 北京 100093

慢性乙型肝炎是由HBV復(fù)制及其引起的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及炎癥，而炎癥反復(fù)存在是疾病進(jìn)展的重要因素[1]。目前臨床上主要以血液學(xué)指標(biāo)(HBsAg、HBeAg、HBV DNA、肝功能等)作為病毒復(fù)制和肝損傷的標(biāo)志，肝組織HBsAg、HBcAg的表達(dá)與肝臟病變程度和臨床特征的關(guān)系，主要是成人的研究[2-5]，而肝組織HBsAg、HBcAg的表達(dá)與抗病毒療效的相關(guān)性目前尚無(wú)研究。本研究對(duì)兒童慢性乙型肝炎患者肝組織HBsAg、HBcAg的表達(dá)與其臨床特征及抗病毒療效做初步的相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年1月—2017年12月在本院青少年肝病科住院的明確診斷為慢性乙型肝炎的6月～16歲兒童患者的病例資料，患者均是初次抗病毒治療。慢性乙型肝炎的診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并甲、丙、戊型病毒性肝炎，肝豆?fàn)詈俗冃?，CMV、EBV合并感染。

1.2 方法 抗病毒治療前查血常規(guī)，肝、腎功能，血糖，乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物，HBV DNA定量，HBsAg定量，甲狀腺功能和自身抗體。在家長(zhǎng)知情同意下行肝臟活組織檢查。治療方案：年齡<1歲的兒童予拉米夫定單藥，如在1歲內(nèi)發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)，一直用拉米夫定，否則1歲后加IFNα，年齡≥1歲的兒童先單用標(biāo)準(zhǔn)IFNα治療，劑量按 3～5 MU/m2體表面積，隔日1次[7]；24周時(shí)如HBV DNA下降≥2 log10或HBsAg清除則繼續(xù)單用IFNα治療，否則加用拉米夫定(年齡<2歲，3 mg·kg-1·d-1)[8]或恩替卡韋(年齡≥2歲，體質(zhì)量15 kg用0.25 mg/d；15～30 kg用0.25/0.5 mg交替，1 次/d；30 kg以上用0.5 mg/d)口服治療。IFNα的療程52～104周。記錄治療和隨訪期間所有的不良事件和合并用藥。

1.3 監(jiān)測(cè)項(xiàng)目 所有兒童每3個(gè)月隨訪，監(jiān)測(cè)血常規(guī)，肝、腎功能，乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物，HBV DNA定量，HBsAg定量，甲狀腺功能和自身抗體等。乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物采用羅氏E170電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，HBsAg定量采用羅氏試劑定量檢測(cè)。HBV DNA檢測(cè)值下限為≤20 IU/ml(COBAS HBV Amplicor MonitorTM)。肝臟病理檢查：應(yīng)用Scheuer標(biāo)準(zhǔn)，肝臟炎癥壞死(G)分級(jí)為0～4，肝纖維化(S)分期為0～4。肝穿刺標(biāo)本鏡下包含4個(gè)及4個(gè)以上可供評(píng)價(jià)匯管區(qū)，由本院病理科醫(yī)師讀片，在光鏡下觀察判定炎癥活動(dòng)度分級(jí)、纖維化分期和肝組織內(nèi)HBsAg、HBcAg的表達(dá)強(qiáng)度。肝組織內(nèi)HBsAg、HBcAg表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化LDP法染色，試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。染色強(qiáng)度參照Chu等[9]提出的標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)肝細(xì)胞著色為(-)，著色肝細(xì)胞小于10%為(+)，10%～50%為(++)，>50%為(+++)。肝組織內(nèi)HBsAg、HBcAg 表達(dá)強(qiáng)度的評(píng)價(jià)參考半定量計(jì)分法:在排除非特異性染色前提下,黃色、棕色和棕褐色顆粒為陽(yáng)性。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2015151D，所有患者家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25～P75)表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。以肝組織 HBsAg和HBcAg染色陽(yáng)性和陰性為應(yīng)變量，以可能影響其表達(dá)強(qiáng)度有意義的相關(guān)因素為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入276例患者，年齡0.5～16歲，中位年齡4.91歲，男性167例(60.51%)，女性109例(39.49%)。213例(77.17%)患者母親HBsAg陽(yáng)性；5例(1.81%)父親HBsAg陽(yáng)性；4例(1.45%)輸血史；20例(7.25%)家庭內(nèi)其他成員HBsAg陽(yáng)性；34例(12.32%)傳染途徑不明。HBeAg陰性14例(5.07%)。肝臟病理提示，肝臟炎癥(G)0～1級(jí)4例(1.45%) ，1級(jí)62例(22.46%)，1～2級(jí)25例(9.06%)，2級(jí)145例(52.54%)，2～3級(jí)19例(6.88%)，3級(jí)21例(7.61%)；肝纖維化分期(S)0期9例(3.26%)，0～1期15例(5.43%)，1期119例(43.12%)，1～2期39例(14.13%)，2期47例(17.03%)，2～3期13例(4.71%)，3期20例(7.25%),3～4期4例(1.45%)，4期10例(3.62%)。276例兒童中肝組織HBsAg表達(dá)陽(yáng)性249例(90.22%),HBsAg陰性27例(9.78%)；肝組織HBcAg表達(dá)陽(yáng)性163例(59.06%),HBcAg陰性113例(40.94%)。

2.2 肝組織HBsAg及HBcAg免疫組化染色的臨床特征比較 依據(jù)肝組織的HBsAg陽(yáng)性及陰性分組、HBcAg陽(yáng)性及陰性分組，分別比較2組兒童的各臨床基線指標(biāo)的差異(表1)。肝組織HBsAg染色陽(yáng)性組年齡及血清HBsAg定量高于陰性組(P值均<0.05)。肝組織HBcAg染色陽(yáng)性組HBeAg陽(yáng)性率高于陰性組，ALT、AST水平及肝組織纖維化分期S≥3期的比例均低于陰性組(P值均<0.05)。

表1 兒童肝組織HBsAg與HBcAg不同分組各臨床基線指標(biāo)的比較

將上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入logistic回歸分析，影響肝組織HBsAg染色陽(yáng)性的因素為血清HBsAg定量(HR=0661，95%CI：0.561～0.711，P=0.015)，影響肝組織HBcAg染色陽(yáng)性的因素為HBeAg陰性或陽(yáng)性(HR=1.512,95%CI:0.751～1.963,P=0.041)。163例肝組織HBcAg陽(yáng)性的兒童中123例(75.46%)為胞漿型，35例(21.47%)為胞漿、胞核混合型，5例(3.07%)為胞核型。

2.3 肝組織HBsAg及HBcAg表達(dá)與HBsAg陰轉(zhuǎn)率、HBeAg轉(zhuǎn)換率的關(guān)系 276例患者中186例完成IFNα或單用拉米夫定停藥，并進(jìn)行了6個(gè)月的隨訪。186例兒童中155例(83.33%)獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，76例(40.86%)獲得HBsAg陰轉(zhuǎn)。

186例患者治療前肝組織HBsAg表達(dá)為-、+、++、+++分別有21例、125例、34例、6例，經(jīng)治療獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換及HBsAg陰轉(zhuǎn)情況見(jiàn)表2。肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)度越高，HBsAg陰轉(zhuǎn)率越低。

186例患者治療前肝組織HBcAg表達(dá)為-、+、++、+++分別有74例、101例、9例、2例，經(jīng)治療獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換及HBsAg陰轉(zhuǎn)情況見(jiàn)表2。肝組織HBcAg表達(dá)強(qiáng)度越高，HBeAg轉(zhuǎn)換率越低。5例肝組織HBcAg陽(yáng)性胞核型的兒童3例完成治療及隨訪，均未獲得HBeAg轉(zhuǎn)換。

表2 186例完成治療的兒童治療前肝組織HBsAg、HBcAg表達(dá)不同療效的差異

2.4 肝組織HBsAg及HBcAg表達(dá)模式與HBsAg陰轉(zhuǎn)率、HBeAg轉(zhuǎn)換率的關(guān)系 將肝組織HBsAg及HBcAg表達(dá)模式分為4種：HBsAg及HBcAg均陰性、HBsAg陰性及HBcAg陽(yáng)性、HBsAg陽(yáng)性及HBcAg陰性、HBsAg及HBcAg均陽(yáng)性。比較4種表達(dá)模式與HBsAg陰轉(zhuǎn)率及HBeAg轉(zhuǎn)換率的關(guān)系：HBeAg轉(zhuǎn)換率和HBsAg陰轉(zhuǎn)率(均100%)以HBsAg及HBcAg均陰性組最高，HBsAg陽(yáng)性及HBcAg陰性組的HBsAg陰轉(zhuǎn)率最低(32.31%)，HBsAg及HBcAg均陽(yáng)性組HBeAg轉(zhuǎn)換率(80%)最低(表3)。

表3 肝組織HBsAg、HBcAg 4 種表達(dá)方式抗病毒療效的差異

3 討論

本組兒童276例肝臟炎癥(G)2級(jí)以上的患者為 63.41%(185例)，3級(jí)為7.61%，無(wú)1例為4級(jí)，考慮與兒童慢性乙型肝炎致肝衰竭的比例較低有關(guān)[10]。肝臟纖維化分期(S)≥3中重度纖維化占12.32%(34例)，較2014年張鴻飛等[11]報(bào)道的重度肝纖維化和肝硬化為14.59%低，較朱世殊等[12]報(bào)道的1～7歲兒童慢性乙型肝炎肝臟重度纖維化為10.9%高?？紤]與近年臨床醫(yī)師對(duì)兒童慢性乙型肝炎的病情評(píng)估以及抗病毒治療的重視有關(guān)，而朱世殊研究的對(duì)象年齡小。但兒童慢性乙型肝炎患者有重度肝纖維化的風(fēng)險(xiǎn)，臨床醫(yī)師應(yīng)重視病情評(píng)估適時(shí)抗病毒治療。

本研究中肝組織HBsAg表達(dá)陽(yáng)性率為90.22%，較吳家箴等[2]報(bào)道的成人研究98.1%和應(yīng)盛等[3]報(bào)道的94.67%低。本組肝組織HBsAg陽(yáng)性組兒童的年齡大于HBsAg陰性組，血清HBsAg定量高于陽(yáng)性組，logistic回歸分析顯示，影響肝組織HBsAg染色的因素為血清HBsAg定量。而成人的研究[2-3]提示HBsAg陽(yáng)性患者的年齡小于HBsAg陰性患者。考慮與兒童患者感染HBV的時(shí)間短以及肝組織病毒學(xué)表達(dá)與成人有差異相關(guān)，本結(jié)果還需擴(kuò)大樣本量，各年齡分段進(jìn)一步證實(shí)。

本組兒童肝組織HBcAg表達(dá)陽(yáng)性為59.06%，高于成人的結(jié)果42.6%和55.63%[2-3]。而且本組肝組織HBcAg陽(yáng)性的兒童中75.46%為胞漿型，21.47%為胞漿、胞核混合型，僅3.07%為胞核型。HBcAg存在HBV Dane顆粒和受感染的肝細(xì)胞中，有極強(qiáng)的免疫原性。成人的研究[13-14]認(rèn)為，在肝組織中HBcAg的表達(dá)由核型、核漿混合型、漿型及核漿陰性的轉(zhuǎn)換(病毒抗原遞呈的改變)，而表現(xiàn)為免疫耐受逐漸被打破。本組兒童肝組織HBcAg陽(yáng)性率高于成人，提示兒童期也可以有明顯的免疫活動(dòng)。而且本組肝組織HBcAg陽(yáng)性的兒童近97%為漿型和漿核混合型，提示這些兒童已經(jīng)打破了免疫耐受。肝組織HBcAg免疫組化染色陽(yáng)性組血清HBeAg陽(yáng)性率高于陰性組，ALT、AST、肝組織纖維化分期S≥3期的比例低于陰性組。但影響肝組織HBcAg染色的因素為HBeAg陽(yáng)性比例。成人的研究[2-3]也同樣得出肝組織內(nèi)HBcAg表達(dá)陽(yáng)性ALT、HBeAg陽(yáng)性的構(gòu)成，肝組織纖維化分期均小于陰性患者。但本組兒童肝組織HBcAg陽(yáng)性患者血清HBV DNA水平及肝臟炎癥程度分級(jí)與陰性組差異不顯著，而成人研究提示肝組織HBcAg陽(yáng)性組HBV DNA水平高于陰性組，肝臟炎癥程度分級(jí)低于陰性組?？紤]與兒童慢性乙型肝炎患者HBV病毒學(xué)特點(diǎn)與成人有差異相關(guān)。

本組完成IFN或拉米夫定單藥停藥的兒童中83.33%獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，其中40.86%獲得HBsAg陰轉(zhuǎn)，較Liu等[15]報(bào)道的單用長(zhǎng)效IFN治療52周的HBeAg轉(zhuǎn)換率49%高，而較HBsAg清除率53.8%低，但均明顯高于成人[1]。考慮與兩組兒童的治療方案不同有關(guān)。對(duì)本組兒童肝組織HBsAg及HBcAg表達(dá)強(qiáng)度分級(jí)，比較不同強(qiáng)度與抗病毒療效的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝組織的HBsAg表達(dá)強(qiáng)度越高，HBsAg陰轉(zhuǎn)率越低。肝組織的HBcAg表達(dá)強(qiáng)度越高，HBeAg血清轉(zhuǎn)換率越低。3例肝組織HBcAg陽(yáng)性胞核型的兒童均未獲得HBeAg轉(zhuǎn)換，提示肝組織HBcAg胞核型陽(yáng)性可能為免疫耐受期。本組兒童發(fā)現(xiàn)肝組織HBsAg、HBcAg均陰性者 HBeAg血清轉(zhuǎn)換率及HBsAg陰轉(zhuǎn)率均最高，而HBsAg陽(yáng)性及HBcAg陰性兒童的HBsAg陰轉(zhuǎn)率最低，HBsAg及HBcAg均陽(yáng)性者HBeAg轉(zhuǎn)換率最低。HBsAg是HBV的外膜蛋白,最近的研究[16]認(rèn)為，針對(duì)HBsAg特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量缺乏和/或功能不足，是導(dǎo)致慢性HBV感染者發(fā)生免疫耐受的重要原因，而兒童HBV感染肝組織不表達(dá)HBsAg是否可能無(wú)這種T淋巴細(xì)胞數(shù)量缺乏和/或功能不足，所以兒童的抗病毒治療優(yōu)于成人還有待于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步證實(shí)。雖然HBcAg是免疫反應(yīng)的主要靶抗原,但HBcAg的表達(dá)強(qiáng)度越高而HBeAg轉(zhuǎn)換率越低，考慮與HBV感染的免疫應(yīng)答為多因子參與以及肝組織HBcAg表達(dá)的組織代表性有限有關(guān)。

由此，本組兒童慢性乙型肝炎患者肝組織HBsAg表達(dá)陽(yáng)性率低于成人，肝組織HBcAg陽(yáng)性率高于成人，肝組織的HBsAg表達(dá)強(qiáng)度越高，HBsAg陰轉(zhuǎn)率越低。肝組織的HBcAg表達(dá)強(qiáng)度越高，HBeAg血清轉(zhuǎn)換率越低。肝組織HBsAg、HBcAg均陰性者HBeAg轉(zhuǎn)換率及HBsAg陰轉(zhuǎn)率均最高。但由于肝穿刺組織的代表性可能會(huì)有偏差，另外抗病毒療效受患者的年齡、ALT、HBV DNA、HBsAg水平及抗病毒治療方案等多因素的影響，因本研究完成抗病毒治療的病例數(shù)較少，故只做初步探索性的比較。肝組織HBsAg、HBeAg的生物學(xué)特點(diǎn)以及與抗病毒治療的關(guān)系還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：王麗旻負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；劉樹(shù)紅、朱世殊、董漪、徐志強(qiáng)、王福川、閆建國(guó)、王璞、李愛(ài)芹、曹麗參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙攀、張敏負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章，并最后定稿。