青海省青稞條紋病菌遺傳多樣性分析

胡章薇，楊 帆，閆佳會(huì)，侯 璐，翁 華，姚 強(qiáng)

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海西寧810016）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.f.）又名裸大麥，為禾本科大麥屬植物，屬于栽培大麥的變種，其特點(diǎn)是成熟時(shí)籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露[1]。青稞在藏族同胞的食物結(jié)構(gòu)中舉足輕重，起著重要的營(yíng)養(yǎng)與健康平衡作用。因其適宜生長(zhǎng)在高原冷涼的區(qū)域，具有耐寒性強(qiáng)、生長(zhǎng)期短、高產(chǎn)早熟、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，以及獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健作用，青稞已成為極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的高原特色農(nóng)作物之一[2]。青稞產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)于保障青藏高原地區(qū)糧食安全、社會(huì)穩(wěn)定和高原特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

青稞條紋病為種子傳播的系統(tǒng)性病害，病菌潛伏于種子中，成為翌年發(fā)病的菌源。控制該病害有效的方法就是使用健康良種，但受經(jīng)濟(jì)發(fā)展和環(huán)境條件等的限制，目前青稞生產(chǎn)用種60%以上依靠農(nóng)戶自留。以糧代種造成了條紋病發(fā)生逐年加重，在青海造成的年均產(chǎn)量損失達(dá)10%左右，嚴(yán)重的高達(dá)25%。青稞條紋病菌為真菌門子囊菌綱盤菌目盤菌科核腔菌屬麥類核腔菌Pyrenophora.graminea，傳統(tǒng)絲狀真菌無(wú)性階段形態(tài)相近，因此，分類鑒定主要依據(jù)真菌的孢子形態(tài)進(jìn)行。青稞條紋病菌在人工培養(yǎng)基上較難產(chǎn)生分生孢子[3]，難以通過(guò)表觀形態(tài)鑒定，而rDNA-ITS序列分析使絲狀真菌的鑒定更容易且更準(zhǔn)確[4]。rDNA-ITS包括ITS1、5.8S和ITS2的全長(zhǎng)ITS區(qū)域序列，擁有相對(duì)豐富的信息，因而全長(zhǎng)序列的ITS分析在真菌分子生物學(xué)鑒定中比較常用[5]。吳寬然對(duì)來(lái)自不同地理區(qū)域的菌株進(jìn)行ITS序列分析，將供試菌株分為3個(gè)大類，共發(fā)現(xiàn)13個(gè)變異位點(diǎn)，15種單核苷酸多態(tài)性類型[6]。通過(guò)rDNA-ITS序列分析能揭示菌株的核苷酸變異，可以更加穩(wěn)定和直接地研究菌株的遺傳分化。本研究通過(guò)對(duì)青海省不同地區(qū)青稞條紋病株進(jìn)行病原菌分離、純化，基于rDNA-ITS進(jìn)行條紋菌群體的遺傳多樣性分析，以期為明確該病害的發(fā)生流行規(guī)律以及制定相關(guān)防控技術(shù)體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株。供試菌株采自青海青稞主產(chǎn)區(qū)（表1）典型條紋病癥狀的發(fā)病葉片標(biāo)樣，保存于標(biāo)本夾，常溫保存。

1.1.2 供試試劑與儀器。供試試劑：瓊脂粉、葡萄糖，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試

劑盒HP Fungal DNA Kit，購(gòu)于Omega Bio-Tek科技有 限 公 司；dNTP Mixture、Loading Buffer，均 購(gòu) 于TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 發(fā)病葉片樣品采集信息

供試儀器：TissueLyser II組織研磨儀，購(gòu)自凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；微量核酸蛋白測(cè)定儀、sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀，均購(gòu)自愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制。PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基配制：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉18 g，加水調(diào)至1 L，121℃下滅菌20 min。

1.2.2 供試菌株分離、純化及保存。病樣沖洗處理干凈后，剪取病、健交界處的組織小段約3 mm，通過(guò)表面消毒處理（75%乙醇30 s，5%次氯酸鈉1 min），無(wú)菌水沖洗3次后，接種在PDA平板培養(yǎng)基上，每皿5塊病組織。各地區(qū)病樣各分離10皿，置于22℃恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，先用挑針挑取上層菌絲，待菌絲長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)用手術(shù)刀切取尖端菌絲，反復(fù)純化5～7次，直至菌絲形態(tài)一致。

由本實(shí)驗(yàn)室分離、純化得到的條紋病菌菌株用濾紙片法保存并驗(yàn)證其活性后，于-20℃冰箱保存。

1.2.3 基因組DNA提取。對(duì)長(zhǎng)滿培養(yǎng)基的各供試菌株，小心挑取菌絲于2 mL離心管中，參考DNA提取試劑盒HP Fungal DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取DNA。獲得的基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，同時(shí)，DNA稀釋10倍后保存于-20℃冰箱，原液保存于-80℃冰箱。

1.2.4 rDNA-ITS區(qū)間擴(kuò)增及遺傳多樣性分析。利用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴(kuò)增條紋病病菌rDNA-ITS區(qū)間，PCR體系為：dNTP Mixture12.5μL，引物各1μL，DNA模板2μL，添加無(wú)菌去離子水至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃預(yù)變性10 min；92℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后確定片段為600 bp左右，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。各菌株測(cè)序結(jié)果于GenBank比對(duì)后，經(jīng)MEGA和DNAsp軟件分析病原菌群體間的遺傳分化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞條紋病病原菌的分離及菌落形態(tài)特征

采自青海青稞主產(chǎn)區(qū)（42個(gè)采集地點(diǎn)）典型條紋病癥狀的發(fā)病葉片，經(jīng)分離純化得到79株病株。培養(yǎng)初期菌絲白色，邊緣整齊，生長(zhǎng)10 d后部分菌株產(chǎn)生白色、灰色、墨綠色和橙色等可溶性色素，導(dǎo)致菌落顏色多變，但均不產(chǎn)生分生孢子（圖1）。

2.2 青稞條紋病病原菌DNA提取及PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

提取已純化的病菌菌絲基因組總DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2-a所示，其總基因組DNA條帶明亮，表明DNA質(zhì)量較好。條紋病病原菌rDNA-ITS區(qū)間片段大小為600 bp左右，利用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增rDNA-ITS區(qū)間，取2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳凝膠顯色確定，擴(kuò)增片段為600 bp左右（圖2-b）。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2.3 條紋病菌遺傳多樣性分析及鄰接聚類分析

采用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增79株條紋病菌rDNA-ITS區(qū)間，其長(zhǎng)度范圍為597～599 bp。各菌株測(cè)序結(jié)果于GenBank比對(duì)后，其中75株與麥類核腔菌Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）同源性最高為98.31%～99.49%，其他4株不確定。經(jīng)MEGA 7.0.14軟件分析75株病原菌的遺傳關(guān)系。對(duì)75條rDNA-ITS序列區(qū)間，以DNAsp軟件進(jìn)行群體多態(tài)性位點(diǎn)分析，最終確定長(zhǎng)度為569 bp序列用于分析。

所有變異位點(diǎn)共定義了5個(gè)單倍型（表2），H1包含70個(gè)菌株，菌株源于青海青稞主要種植區(qū)。2個(gè)單倍型（H2和H3）菌株（DLXRD1和DLXRD2）采自海西蒙古族自治州都蘭縣香日德鎮(zhèn)。其余2個(gè)單倍 型（H4和H5）的 菌 株（LDMY1、LDMY2和GNSD2）分別采自海東市樂(lè)都縣馬營(yíng)鄉(xiāng)和海南藏族自治州貴南縣森多鄉(xiāng)。結(jié)果表明，該段序列具有較低的遺傳多樣性水平。根據(jù)DNAsp軟件分析，得到多態(tài)位點(diǎn)有18個(gè)，占總位點(diǎn)的3.16%，其中有8個(gè)位點(diǎn)是因?yàn)閴A基缺失造成的。這18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中單類型多態(tài)性位點(diǎn)有14個(gè)，簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)有4個(gè)，沒(méi)有3種或4種多態(tài)性位點(diǎn)。分析表明，Pyrenophora graminea的該段序列較為保守，突變也較為隨機(jī)，僅有點(diǎn)突變。

鄰接（Neighbor-Joining，NJ）聚類分析表明（圖3），75個(gè)rDNA-ITS序列聚成5支，且遺傳相似度較高（0.002～0.027）；H4（LDMY1和LDMY2）與Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）聚 為一支；H5（GNSD2）獨(dú)立聚為一支，與其他支遺傳距離距離較遠(yuǎn)。

表2 Pyrenophora graminea 5個(gè)單倍型的ITS序列差異位點(diǎn)

3 討論與結(jié)論

本研究所分離純化的條紋病菌株在菌絲顏色、菌絲形態(tài)方面存在差異，且同株分離的條紋病菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)多樣，但基于rDNA-ITS的測(cè)序結(jié)果表現(xiàn)一致。可能是控制色素和形態(tài)的基因不在rDNA-ITS區(qū)間。如需劃分生理小種，還要進(jìn)一步選取其他基因序列。

rDNA-ITS區(qū)在真菌種間存在著豐富的變異，在種內(nèi)卻高度保守，同時(shí)，ITS片段的進(jìn)化速率是18SrDNA的10倍，這是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)[7]，已廣泛運(yùn)用于植物檢疫[8-9]。本研究采樣寄主均為青稞，各菌株測(cè)序結(jié)果于GenBank比對(duì)后，其中75株與麥類核腔菌Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）同 源性最高。rDNA-ITS序列區(qū)間經(jīng)DNAsp軟件進(jìn)行群體多態(tài)性位點(diǎn)分析，所有變異位點(diǎn)共定義了5個(gè)單倍型，有5株菌株發(fā)生點(diǎn)突變，變異位點(diǎn)有18個(gè)，共3種變異類型。吳寬然檢測(cè)大麥條紋病菌株間ITS變異位點(diǎn)，共檢測(cè)到13個(gè)變異位點(diǎn)，15種位點(diǎn)變化[6]，與本研究相比，變異位點(diǎn)更少但變異類型更多，可能與青海特殊地理環(huán)境及本試驗(yàn)樣品采集樣本的寄主均為青稞有關(guān)。其中H5（GNSD2）獨(dú)立聚為一支且變異位點(diǎn)較多，可能是由于其采集點(diǎn)的海拔最高，地理位置相對(duì)其他區(qū)域較遠(yuǎn)引起的。單倍型多樣性（Hd）和鄰接聚類分析是評(píng)價(jià)遺傳多樣性的重要指標(biāo)。根據(jù)單倍型多樣性（H）和鄰接聚類分析數(shù)據(jù)表明，所有變異位點(diǎn)共定義了5個(gè)單倍型，75個(gè)rDNA-ITS單倍型聚成5支，且遺傳相似度較高（0.002～0.027），與單倍型結(jié)果一致，表明該群體具有較低的遺傳多樣性水平，且遺傳多樣性與地理位置的分布無(wú)相關(guān)性。這與Bayraktar等[10]和司二靜等[4]的研究結(jié)果類似，造成該現(xiàn)象的原因可能與青稞條紋病為種傳病害有關(guān)。

本研究在青稞生長(zhǎng)季節(jié)對(duì)主要種植區(qū)的條紋病采集標(biāo)樣，進(jìn)行病原菌分離、培養(yǎng)和純化，基于條紋病菌群體的rDNA-ITS序列進(jìn)行群體遺傳多樣性分析及變異位點(diǎn)分析，明確了青海條紋病菌優(yōu)勢(shì)毒性類群及其相應(yīng)的差異位點(diǎn)。抗病育種是病害防治經(jīng)濟(jì)有效的途徑，抗性評(píng)價(jià)是抗病育種的前提條件，本研究對(duì)青海條紋病優(yōu)勢(shì)毒性類群進(jìn)行了初步的分類，可為青海青稞品種抗性評(píng)價(jià)提供主要毒性類群。同時(shí)，本研究所分離純化的菌株培養(yǎng)10 d后，其生長(zhǎng)速度、菌絲顏色和菌絲致密程度等方面均存在差異，可為生理小種的劃分提供理論依據(jù)。