玉米ZmRab6A基因的克隆與生物信息學分析

時丕彪，胡鳳琴，顧小兵，呂遠大

（1.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗站，江蘇鹽城224049；2.中國科學院南京土壤研究所，江蘇南京210008 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質資源與生物技術研究所，江蘇南京210014；）

Rab蛋白是一類小分子量三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate,GTP）結合蛋白，主要參與細胞器間的膜轉運，將貨物蛋白通過囊泡運輸?shù)侥康牡豙1]。GTP結合蛋白在GTP與之結合時被激活，在GTP水解為GDP過程中失活，因此這類蛋白在這些過程中起著分子開關的作用[2-3]。Rab基因家族是植物重要的一類超大基因家族。研究表明，Rab家族不僅與植物的生長發(fā)育密切相關，而且在逆境脅迫和抗病方面也發(fā)揮著重要的作用[4]。目前，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)57個Rab蛋白，并將其分為8個亞家族：RabA～H[5]。T-DNA插入突變體試驗表明，AtRabD2b和AtRabD2c在擬南芥花粉發(fā)育和花粉管生長方面起著重要的作用，并且它們在功能上是冗余的[6]。煙草中過量表達NtRab2基因會抑制花粉管的生長[7]。而將御谷PgRab7基因轉入煙草中能顯著增強煙草對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性，說明PgRab7基因可能參與了植物脅迫響應[8]。在轉基因水稻中過表達OsRab11基因，發(fā)現(xiàn)通過影響茉莉酸代謝途徑相關基因的表達，增強了植株對病原菌的抗性[9]。TaRab7基因在小麥與條銹菌互作早期和抗逆性中起著重要的作用[10]。PtRabE1b的過量表達增強了楊樹的耐鹽性[11]。

玉米為世界上重要的糧食作物之一，關于Rab基因在玉米中的研究較少。因此，本研究克隆了玉米ZmRab6A基因并對其序列進行測定，分析了其編碼蛋白的理化性質、保守結構域、二級結構、三級結構及與其他物種的親緣關系等特征，為下一步研究其分子生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

玉米材料為筆者所在課題組保存的玉米自交系B73。取健壯幼苗的葉片組織，液氮速凍后保存在-80℃冰箱用于RNA提取。

1.2 玉米總RNA提取及cDNA合成

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明書提取玉米葉片總RNA。按照美國Thermo Scientific公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第1條鏈，作為PCR擴增的模板。

1.3 玉米ZmRab6A基因的克隆

根據(jù)GeneBank登錄的ZmRab6A基因序列，設計1對基因特異性引物，正向引物F：5'-CCCTGGT CTGTGGCCTCTGCGCTCC-3'，反向引物R：5'-TTATTTCGAAACAAAAGACCCGGTGT GATTC-3'，進行PCR擴增。擴增體系總體積50μL，其中2×Taq Master Mix 25μL，cDNA模板1μL，正反向引物各1μL，ddH2O 22μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pMD18-T載體，然后轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。菌液PCR驗證為陽性單菌落的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4 ZmRab6A基因的生物信息學分析

利用ORF finder在線分析ZmRab6A基因的開放閱讀框架并翻譯成氨基酸，利用Ex PASy Prot Param預測ZmRab6A編碼蛋白的相對分子量和理論等電點，分別使用在線軟件GORⅣ和SWISS-MODEL預測蛋白的二級結構和三級結構，用國家生物技術信息中心的保守結構域數(shù)據(jù)庫NCBI CDD分析蛋白的保守結構域，Prot Scale在線預測蛋白的親疏水性，分別利用SignalP-5.0和TMHMM Server v.2.0分析信號肽和跨膜區(qū)域的有無，采用蛋白質亞細胞定位預測工具PSORT預測亞細胞定位。使用MEGA 5.05軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）（自展值bootstrap=1 000）構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 ZmRab6A基因的克隆

利用特異性引物進行RT-PCR擴增，從玉米葉片中克隆得到ZmRab6A基因1 044 bp的cDNA全長序列（圖1）。序列分析表明，該基因含有1個660 bp的開放閱讀框，編碼219個氨基酸；5'非翻譯區(qū)長155 bp，3'非翻譯區(qū)長229 bp（圖2）。在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6個外顯子和5個內含子，全長2 650 bp。

2.2 ZmRab6A的理化性質分析

利用ExPASy ProtParam分析ZmRab6A蛋白的理化性質，結果表明：其分子式為C1076H1726N288O338S9，相對分子量為24.39 ku，理論等電點為5.58；帶負電荷殘基（Asp+Glu）28個，帶正電荷殘基（Arg+Lys）26個；不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪族指數(shù)分別為46.68和86.76，推測ZmRab6A為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 ZmRab6A蛋白的親/疏水性分析

利用ProtScale預測ZmRab6A蛋白的親水性/疏水性，結果如圖3所示，該蛋白的N末端有一個很強的疏水性結構，第128位和129位異亮氨酸（Ile）疏水性最強，分值為2.344；C末端有一個很強的親水性結構，第209位絲氨酸（Ser）親水性最強，分值為-2.600。該蛋白的總平均親水性值為-0.173，推測其可能是親水蛋白。

2.4 ZmRab6A的跨膜區(qū)域和信號肽預測

利用TMHMMServer v.2.0預測ZmRab6A蛋白的跨膜區(qū)域，結果顯示，該蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)，屬于非跨膜蛋白質（圖4）。使用SignalP-5.0預測ZmRab6A信號肽的可能性，其值為0.004，因此該蛋白沒有信號肽，屬于非分泌蛋白（圖5）。

2.5 ZmRab6A蛋白的保守結構域分析

結構域預測結果表明，ZmRab6A具有Rab蛋白典型的G結構域（G1、G2、G3、G4和G5），具有Rab6特異性位點，含有GTP/Mg2+結合位點，Rab蛋白特征序列RabF1、RabF2、RabF3、RabF4和RabF5，Rab亞家族序列RabSF1、RabSF2、RabSF3和RabSF4，開關Ⅰ、Ⅱ區(qū)域，同時還包含GEF互作位點、GDI互作位點和效應器互作位點，屬于P-loop_NTPase超家族。

2.6 ZmRab6A蛋白的亞細胞定位預測

PSORT預測結果表明，ZmRab6A主要定位于細胞質膜（45%），其次是葉綠體類囊體膜（28%）、葉綠體基質（20%）和葉綠體類囊體空間（20%）。因此，推測ZmRab6A可能是一種胞質蛋白。

2.7 ZmRab6A蛋白的二級結構和三級結構預測

二級結構預測結果表明，ZmRab6A蛋白主要由α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈構成，其中無規(guī)卷曲占比最大，為39.73%；其次是α-螺旋，占比37.90%；延伸鏈占22.37%（圖6-A）。三級結構預測結果表明，ZmRab6A蛋白的空間結構主要是無規(guī)卷曲和α-螺旋，含有少量延伸鏈，與二級結構預測結果一致（圖6-B）。

2.8 系統(tǒng)進化關系分析

基于NCBI的nr（non-redundant protein）蛋白數(shù)據(jù)庫，利用BLASTP程序，比對得到其他物種Rab蛋白的氨基酸序列。序列比對結果表明，ZmRab6A蛋白與高粱（Sorghum bicolor，XP_002461043.1）的一致性最高，達94%；其次是狗尾草（Setaria viridis，XP_034580146.1）和谷子（Setaria italica，XP_022679 790.1），均達92%；與菠蘿（Ananas comosus，XP_020 104318.1）、藜麥（Chenopodium quinoa，XP_02176572 6.1）、牽牛（Ipomoea nil，XP_019177322.1）、罌粟（Papaver somniferum，XP_026401556.1）、美花煙草（Nicotiana sylvestris，XP_009766624.1） 和 番 茄（Solanum lycopersicum，XP_004229706.1）的一致性分別為87%、86%、86%、85%、85%和85%；與亞麻芥（Camelina sativa，XP_010437115.1）、大 葉 藻（Zostera marina，KMZ76111.1）和 一 串 紅（Salvia splendens，TEY33177.1）的一致性分別為76%、76%和75%；與狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，XP_019416581.1）和 野 生 大 豆（Glycine soja，KHN31372.1）的一致性均為67%。以上均表現(xiàn)出較高的同源性。

系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，玉米與同屬禾本科的高粱、狗尾草和谷子的Rab6A蛋白處于同一分支，親緣關系最近；與一串紅、亞麻芥和大葉藻的Rab6A親緣關系較遠，與豆科植物野生大豆和狹葉羽扇豆的親緣關系最遠（圖7）。

3 討論與結論

Rab GTP結合蛋白作為囊泡轉運的重要蛋白，參與了囊泡從供體細胞器出芽、與靶膜對接、拴系和融合的整個轉運過程[12-13]。Rab家族在酵母、哺乳動物和高等植物中具有高度的保守性[14]，為生物有機體囊泡轉運提供了一致的基礎。目前，擬南芥Rab蛋白家族已被鑒定和詳細分析。每個Rab成員約有200個氨基酸，并且序列具有高度相似性。所有Rab蛋白均具有5個典型的保守結構域，包括4個鳥嘌呤核苷酸結合結構域（G1、G3、G4和G5）與1個效應器結合結構域（G2）[3,15]。其中，G1是磷酸或Mg2+的結合位點，G4和G5是參與GTP-GDP結合和水解的關鍵位點。Rab在植物生長發(fā)育以及響應生物脅迫和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。例如，Rab蛋白影響著花粉管的生長[7]、葉片形態(tài)[16]、木質部發(fā)育[17]、自噬[18]、鹽分脅迫[19]和病原菌防御[16]等。小分子量GTP結合蛋白Rab6主要是調控囊泡從高爾基體到內質網(wǎng)的逆向運輸[20]。研究表明，AtRab6A與擬南芥根系發(fā)育密切相關[21]；OsRab6A參與調控水稻生長、糧食產(chǎn)量和鐵元素的積累以響應大氣中升高的CO2濃度[22]。

本研究以玉米ZmRab6A基因為研究對象，利用RT-PCR技術成功克隆了該基因的cDNA全長序列，并在DNA水平上分析了其基因結構。采用各種生物信息學軟件對其編碼蛋白ZmRab6A的理化性質、親/疏水性、保守結構域和二級結構等進行分析，結果表明，ZmRab6A基因cDNA全長1 044 bp，含有1個660 bp的開放閱讀框，編碼219個氨基酸；在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6個外顯子和5個內含子，全長2 650 bp；ZmRab6A蛋白二級結構多為無規(guī)卷曲和α-螺旋，是一種無跨膜區(qū)域和信號肽的不穩(wěn)定親水性胞質蛋白，具有G結構域和Rab6特異性位點，屬于P-loop_NTPase超家族蛋白。系統(tǒng)進化關系分析表明，玉米ZmRab6A與高粱、狗尾草和谷子中的親緣關系最近，這與植物分類地位一致。以上研究為后續(xù)探討ZmRab6A的生物學功能奠定了基礎。