IL-33 通過ST2 改變MDSC 功能參與MCMV 肺炎*

郭秉楠，燕憲亮，許 鐵

(徐州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生應(yīng)急研究所，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心，徐州 221004)

巨細(xì)胞病毒肺炎其病理表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、上皮細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬等，嚴(yán)重者發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征[1]。同時，作為免疫功能低下人群感染人巨細(xì)胞病毒所誘發(fā)的最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率為50%～70%，死亡率高達(dá)25%～31%[2]。因而，探討其發(fā)病機(jī)制以便更好地防治顯得尤為重要。本文在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-33(interleukin-33,IL-33)蛋白促進(jìn)鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)肺炎的進(jìn)程可能是通過肺組織中大量骨髓原性的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)活化實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 6～8 周齡Balb/c 小鼠購于徐州醫(yī)科大學(xué)，ST2-/-小鼠由蘇州大學(xué)腫瘤與分子實(shí)驗(yàn)室饋贈，所有小鼠均在無菌條件下飼養(yǎng)，研究符合徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會要求；MCMV(Smith 株)由山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院秦立增教授饋贈；低熔點(diǎn)瓊脂糖購于Sigma 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基，胎牛血清購自Gibco 公司；實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)試劑盒購于Thermo Fisher；IL-33 酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunoabsorbent assay,ELISA)檢測試劑盒，流式抗體Anti-CD11b-APC(M1/70)、Anti-Gr1-PE(RB6-85C)購于Biolegend 公司；引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SDS-PAGE 和Western Blot IL-33 蛋白樣品中加入5×Loading buffer，100 ℃煮樣10 min；電泳1.5 h后，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色，至蛋白條帶清晰，拍照保存。SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后，等滲鹽緩沖液(Tris buffered saline Tween,TBST)漂洗3 次，10 min/次；二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h 后，TBST 漂洗3 次，10 min/次；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)法檢測并拍照分析條帶灰度值。

1.2.2 ST2-/-小鼠的鑒定 取待鑒定小鼠尾巴2 mm于EP 管中，加入蛋白酶K 裂解液，55 ℃水浴過夜后，4 ℃，12 000 g，離心5 min，取上清進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定小鼠基因型。引物1：5′-TTGGCTTCTTTTAATAGGCCC-3′；引物2：5′-CTATCAGGACATAGCGTTGGCTACC-3′；引物3：5′-TGTTGAAGCCAAGAGCTTACC-3′；引物1加引物3 能夠得到長度約500 bp 的野生型條帶；引物2 加引物3 能夠得到長度約370 bp 的ST2 敲除條帶。

1.2.3 小鼠MCMV 肺炎模型的建立 取6～8 周齡雌性Balb/c 小鼠，鼻腔接種感染5×105空斑形成單位(plaque forming unit,PFU)的MCMV(Smith 株)，連續(xù)感染3、7 d 后評價肺部感染情況。

1.2.4 病理學(xué)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,H&E)染色 取小鼠肺組織，固定并石蠟包埋切片，H&E染色，顯微鏡下觀測實(shí)驗(yàn)鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡損傷及局灶壞死情況并評分，血管炎癥為1 分；支氣管炎癥為2 分；肺間質(zhì)炎性浸潤或肺泡間隔增厚為3 分；細(xì)胞病毒樣病變?yōu)? 分。

1.2.5 空斑實(shí)驗(yàn)測定MCMV 病毒載量 取MCMV感染小鼠的肺組織100 mg，膠原酶消化，制備單細(xì)胞懸液，種于含DMEM 完全培養(yǎng)基的6 孔板中，待細(xì)胞長滿單層約80%時，棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗2 遍，將2.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×DMEM 以1∶1 混合加到6 孔板中，室溫凝固后，37 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)4～5 d，待出現(xiàn)蝕斑后，移去瓊脂，加細(xì)胞染色液覆蓋，3～5 min，雙蒸水沖洗2 次，計(jì)算PFU。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSC 制備肺單細(xì)胞懸液后，流式緩沖液洗2 遍，將Anti-CD11b-APC 和Anti-Gr1-PE 抗體(1∶1 000)與細(xì)胞4 ℃避光孵育30 min，流式緩沖液洗2 遍，用流式細(xì)胞儀(FACS CantoⅡ)進(jìn)行檢測，F(xiàn)lowjo 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.7 Real-time PCR 實(shí)驗(yàn) 利用RNeasy 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，Reverse Transcriptase superscript Ⅱ試劑盒合成cDNA，Sybr green Real-time PCR 試劑盒及LC480 Real-time PCR 進(jìn)行檢測相應(yīng)引物的細(xì)胞因子，以β-actin 為內(nèi)參，引物序列見表1。

1.2.8 ELISA 檢測IL-33 96 孔板每孔加100 μL含捕獲抗體的包被液4 ℃過夜；含5%曲拉通X-100的磷酸緩沖鹽溶液(5% Triton X-100 in phosphate buffered saline,5%PBST)洗4 次；1%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h；5%PBST 洗4 次；100 μL/孔加入待檢測組織勻漿液，37 ℃孵育2 h；5%PBST 洗4 次；100 μL/孔檢測抗體，37 ℃孵育1.5 h；5%PBST 洗4次；每孔加100 μL Avidin-HRP，37 ℃孵育0.5 h；5%PBST 洗4 次；顯色液顯色5～10 min。OD492讀數(shù)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 IL-33蛋白的表達(dá)純化及ST2-/-小鼠的鑒定 首先，構(gòu)建重組IL-33 基因至原核表達(dá)載體pET43.1，在BL-21 宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)，純化目的蛋白(圖1A～B)。隨后，通過PCR 法驗(yàn)證ST2-/-小鼠(圖1C)，ST2 野生型小鼠通過引物擴(kuò)增得到約500 bp 條帶，ST2-/-型小鼠通過引物擴(kuò)增得到約370 bp 條帶。

2.2 小鼠MCMV 肺炎模型的建立 文獻(xiàn)[3]報道，小鼠MCMV 肺炎模型可通過鼻腔接種MCMV 病毒建立。5×105PFU 的MCMV(Smith 株)，連續(xù)感染3 d、7 d后取小鼠肺組織進(jìn)行H&E 染色發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)肺炎的病理表現(xiàn)(圖2A)；Real-time PCR 和組織勻漿ELISA 檢測IL-33 mRNA 和蛋白水平顯示：MCMV處理組肺組織中IL-33 的mRNA 和蛋白水平顯著升高(P＜0.05)(圖2B～C)。以上結(jié)果表明：經(jīng)MCMV 處理后，成功建立小鼠MCMV 肺炎模型。

2.3 IL-33 蛋白加重小鼠MCMV 肺炎 上述模型進(jìn)一步尾靜脈注射IL-33 蛋白，發(fā)現(xiàn)IL-33 蛋白含量在肺組織中顯著升高，且在第5 天達(dá)到峰值，之后緩慢下降(圖3B)；分別在不同時間點(diǎn)取肺組織進(jìn)行H&E 染色并進(jìn)行病理評分，發(fā)現(xiàn)第7 天小鼠肺炎病理表現(xiàn)最為嚴(yán)重(圖3A、C)；不同時間點(diǎn)取小鼠肺組織空斑實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-33 蛋白處理組中MCMV病毒浸潤顯著升高(P＜0.05)(圖3A、D)；然而，在ST2-/-小鼠中建立MCMV 肺炎模型后，尾靜脈注射IL-33蛋白發(fā)現(xiàn)：與WT 小鼠比較，感染后第7 天ST2-/-小鼠肺炎病理表現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)(圖3A)，同時其肺組織中的MCMV 病毒含量亦顯著降低(P＜0.05)(圖3D)。以上結(jié)果表明IL-33 可以加重小鼠MCMV肺炎。

2.4 肺MDSC 介導(dǎo)IL-33 蛋白加重小鼠MCMV 肺炎 隨后，取野生型及ST2-/-小鼠的肺組織，制備單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠肺組織中CD11b+Gr1+MDSC 的表面高表達(dá)IL-33 受體ST2(圖4A～B)；與對照組比較，野生型小鼠經(jīng)IL-33 蛋白處理組肺組織中大量浸潤C(jī)D11b+Gr1+MDSC(P＜0.05)(圖4C～D)；ST2-/-小鼠經(jīng)過IL-33 蛋白處理組肺中MDSC 細(xì)胞并無顯著增加(圖4C～D)。以上結(jié)果表明，IL-33 加重小鼠MCMV 肺炎可能是由于IL-33 與MDSC 表面ST2 受體相結(jié)合導(dǎo)致MDSC 大量擴(kuò)增而引起。

2.5 IL-33 促進(jìn)肺MDSC 發(fā)揮免疫抑制功能 首先分選得到MCMV 肺炎模型及對照組小鼠肺組織中的MDSC，通過Real-time PCR 分析與MDSC 生成且發(fā)揮免疫抑制作用相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)，IL-33 處理組MDSC 功能相關(guān)的Arginase-1、iNOS 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高；Th2 型細(xì)胞因子IL-13 而不是IL-4的mRNA 表達(dá)水平顯著升高；相反的，Th1 型細(xì)胞因子IL-12 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低(圖5)。

3 討 論

IL-33 是2005 年J.SCHMITZ 等[4]發(fā)現(xiàn)的IL-1 家族的新成員，多表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及活化態(tài)的免疫細(xì)胞上[5]。IL-33 作為一種新型損傷相關(guān)分子模式/警報素(damage associated molecular patterns,DAMPs/Alarmins)，在炎性刺激、細(xì)胞壞死及機(jī)械損傷等條件下分泌到胞外發(fā)揮生物學(xué)功能[6-7]，可促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，分泌Th2 型細(xì)胞因子(IL-5、IL-10、IL-13)。在哮喘時，當(dāng)患者暴露于過敏原時，肥大細(xì)胞活化并分泌成熟的IL-33，高效激活Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞(group-2 innate lymphoid cells,ILC2s)，釋放大量Th2 型細(xì)胞因子，同時也抑制了Th1 型細(xì)胞因子的分泌[8]。IL-33/ST2 通路的激活對博來霉素誘導(dǎo)的纖維化肺損傷的形成有著重要的促進(jìn)作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-33 可以促進(jìn)MCMV 肺炎的發(fā)展，可能是由于IL-33 調(diào)控肺中MDSC 的活化，活化的MDSC發(fā)揮免疫抑制功能而實(shí)現(xiàn)的。

在肺部感染過程中，炎癥因子的釋放和DAMPs/Alarmins 可以誘發(fā)宿主損傷甚至死亡[10]。其中，炎癥因子和DAMP/Alarmins 可以誘導(dǎo)骨髓生成大量MDSC，MDSC 在趨化因子的作用下向感染部位遷移，并被馴化、激活，表現(xiàn)出自身吞噬能力下降、加速自身凋亡，抑制T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力[11]。IL-33 作為一種新型的“Alarmin”在炎癥過程中可以迅速釋放到胞外警示免疫系統(tǒng)組織損傷，活化免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。在野生型小鼠MCMV 肺炎模型中，外源加入IL-33 蛋白后，肺炎癥狀更加嚴(yán)重，且肺組織中IL-33 含量顯著升高，并伴隨肺組織MDSCs 浸潤顯著升高。然而，在ST2-/-小鼠中，外源加入IL-33 蛋白后，雖然肺組織中IL-33 含量與野生型小鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其肺炎的病理學(xué)癥狀較野生型小鼠顯著降低，并且肺組織中MDSC浸潤亦顯著低于野生型小鼠組。以上結(jié)果提示，IL-33 促進(jìn)MCMV肺炎可能是由于與MDSC 表面的ST2 受體相結(jié)合活化了MDSC，而活化的MDSC 在肺組織中大量浸潤發(fā)揮免疫抑制功能從而加重了肺炎的癥狀。

MDSC 是一群異質(zhì)性的、不成熟的髓系細(xì)胞[12]，在腫瘤、炎癥以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的免疫抑制作用[13-15]。MDSC 抑制免疫應(yīng)答的主要機(jī)制有[16]：(1)產(chǎn)生Arginase-1，iNOS 等，抑制T 細(xì)胞增殖。(2)產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及一氧化氮，抑制T 細(xì)胞信號傳導(dǎo)。(3)產(chǎn)生免疫抑制分子IL-10，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)抑制自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的功能。(4)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的發(fā)育，間接抑制免疫應(yīng)答。本研究對MCMV 肺炎小鼠注射外源IL-33 蛋白，分選肺中MDSC 后，通過Realtime PCR 發(fā)現(xiàn)Arginase-1 和iNOS 免疫抑制性分子與對照組相比顯著上調(diào)，顯示IL-33 活化的肺MDSC 具有顯著的免疫抑制作用。同時，IL-13 作為一種Th2 型細(xì)胞因子，也可能破壞肺上皮細(xì)胞的完整性等多種機(jī)制參與肺氣道炎癥及肺高敏反應(yīng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCMV 肺炎模型組中，IL-33 加劇了肺MDSC 高表達(dá)IL-13，亦對IL-33 通過活化MDSC 促進(jìn)巨細(xì)胞病毒肺炎提供了證據(jù)。

雖然本研究能夠證實(shí)IL-33 促進(jìn)MCMV 肺炎是通過活化MDSC 實(shí)現(xiàn)的，亦發(fā)現(xiàn)了MDSC 發(fā)揮免疫抑制功能的相關(guān)分子的顯著升高，但是MDSC 是否能夠促進(jìn)肺中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，對肺中的T 細(xì)胞是否有直接的抑制作用等機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。本研究拓展了MCMV 肺炎的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治MCMV 肺炎提供了理論基礎(chǔ)。