利用光遺傳學技術(shù)構(gòu)建小鼠光控心臟起搏模型

葛焰，王偉，劉潔玉，曾博

(西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所，醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室，四川瀘州646000)

電刺激心臟起搏是廣泛用于臨床治療和實驗室研究的心臟起搏技術(shù)，基本作用原理為使用起搏器即電脈沖信號發(fā)生器向局部心肌組織直接施加特定頻率的電刺激，使該區(qū)域心肌細胞膜電位去極化，產(chǎn)生動作電位并將興奮傳導至相鄰區(qū)域的心肌組織，使心臟激動和收縮(Roth，1994)。雖然電刺激心臟起搏器已經(jīng)在臨床應用上取得了很大的成功，但是在實驗室研究，特別是使用小鼠作為疾病模型的心律失常研究中電刺激起搏還存在明顯的技術(shù)缺陷，如只能用于引發(fā)動作電位的短暫去極化，不能長時間持續(xù)刺激(Bruegmannetal.，2010)；導致不同部位的心肌產(chǎn)生不均勻的去極化和超極化區(qū)域(Gillisetal.，1996)；電刺激作用于目標區(qū)域的所有細胞，包括心肌細胞、成纖維細胞、心肌浸潤的巨噬細胞等，不能選擇性作用于心肌細胞(Zagliaetal.，2019)；電解組織液產(chǎn)生氫氣、氧氣、氯氣等組織損傷性氣體并改變局部pH值等(Merrilletal.，2005)。為了避免以上問題，需要開發(fā)新的心臟起搏技術(shù)對電刺激技術(shù)進行補充或替代。

光遺傳學(Deisserothetal.，2006)是利用基因重組技術(shù)，將光敏感的生物元件導入細胞、組織或個體中，對特定的生物學功能進行研究的新型技術(shù)手段，目前使用最多的光遺傳學工具是視紫紅質(zhì)通道蛋白2 (channelrhodopsin-2，ChR2)，該蛋白是一種藍光激活的陽離子通道(Nageletal.，2003)，將ChR2表達于可興奮的靶細胞或靶器官上，利用一定強度的藍光將其激活開放即可實現(xiàn)對細胞、組織、器官及動物生理功能的精細調(diào)控(Lerneretal.，2016；Leeetal.，2020)。心臟光遺傳學是一個新興的研究方向(Jiaetal.，2011)，一般是指將ChR2特異性表達于心肌細胞上，通過藍光照射使ChR2通道開放，胞外陽離子流入細胞內(nèi)，使細胞膜電位去極化，從而引發(fā)心肌細胞產(chǎn)生動作電位，電活動可以從少數(shù)心肌細胞向周圍相鄰的心肌細胞傳導，最終使整個心臟興奮和收縮(Entcheva，2013)?；谝陨显恚狙芯渴褂眯募√禺愋訡re重組酶表達小鼠與ChR2融合tdTomato熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交獲得了心肌特異性ChR2-tdTomato表達小鼠，并使用藍光照射對小鼠的心臟搏動進行了精確控制，成功構(gòu)建了光控小鼠心臟起搏模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物αMHC-Cre和ChR2(H134R)-tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson Laboratory，在西南醫(yī)科大學實驗動物中心SPF動物房進行繁育[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-17,實驗動物使用許可證號：SCXK(川)2018-065]，飼養(yǎng)過程中給予充足的飲水和飼料。動物實驗經(jīng)西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審核批準，在醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室進行。

1.1.2 試劑NaOH、Tris-HCl、瓊脂糖、核酸染料、D2000 DNA Marker和TAE緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司，2×Es Taq MasterMix購自康為世紀生物科技有限公司，小鼠基因型鑒定引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成，麻醉藥物戊巴比妥鈉由西南醫(yī)科大學統(tǒng)一訂購分配使用。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖策略研究使用的αMHC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠為αMHC啟動子驅(qū)動的心肌特異性Cre重組酶表達小鼠，ChR2(H134R)-tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠在通用型CAG啟動子和ChR2(H134R)-tdTomato融合基因之間插入了2個LoxP位點和STOP終止序列，在沒有Cre重組酶的情況下，ChR2(H134R)-tdTomato不表達。將2種轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后，在心肌細胞中表達的Cre重組酶對2個LoxP位點進行剪切和重組，中間的STOP序列被切除，ChR2(H134R)-tdTomato融合蛋白得以表達(圖1)。ChR2(H134R)是ChR2的突變體，在藍光刺激下具有更高的活性，產(chǎn)生約2倍的光電流，去極化作用更顯著(Nageletal.，2005)，但是基本特性與ChR2相同，后文中將其簡稱為ChR2。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定2種轉(zhuǎn)基因小鼠及其雜交后代的基因型鑒定使用αMHC-Cre和ChR2特異性引物(表1)對鼠尾DNA進行PCR擴增，根據(jù)產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷基因型。鼠尾DNA提取采用堿裂解法，取鼠尾(0.5～1 mm)于300 μL 50 mmol·L-1NaOH溶液中，100 ℃金屬浴30 min，冷卻后加入25 μL 1 mol·L-1Tris-HCl (pH8.0)混勻，用作PCR模板。PCR體系(20 μL)：ddH2O 7 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL。PCR程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，63/57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 1 min，10 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后成像分析。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定引物Table 1 Genotyping primers of transgenic mice

1.2.3 小鼠心臟熒光表型鑒定取成年小鼠腹腔注射0.2 mL 1%戊巴比妥鈉溶液，麻醉后手術(shù)開胸暴露心臟，用561 nm LED光源照射整個胸腔(圖2：A)，使用590～650 nm波段濾光片和普通相機捕獲tdTomato熒光并成像(圖2：B、C)。

1.2.4 小鼠光控心臟起搏取成年小鼠腹腔注射0.2 mL 1%戊巴比妥鈉溶液，待小鼠麻醉約15 min后行氣管插管(呼吸頻率130次/min，呼吸時比5∶4，潮氣量2 mL)，手術(shù)開胸后暴露心臟，將藍光刺激器對準心臟，使用針灸針穿刺四肢皮膚，連接導線進行心電圖記錄(圖2：D、E)。

2 結(jié)果

2.1 雜交小鼠基因型和熒光表型

將αMHC-Cre小鼠和ChR2-tdTomato小鼠進行雜交獲得了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+(心肌特異性表達Cre和ChR2-tdTomato)、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-(心肌特異性表達Cre但不攜帶ChR2-tdTomato基因)和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+(不表達Cre，攜帶ChR2-tdTomato基因但由于上游終止序列的存在而無法表達)3種基因型的小鼠。在561 nm LED光源的激發(fā)下(圖2：A)，αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠的心臟發(fā)出明亮的紅色熒光且在其他部位沒有熒光(圖2：B)，說明ChR2-tdTomato融合蛋白在該基因型小鼠心臟中具有組織特異性的高水平表達。同樣條件下，αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠心臟及其他部位均沒有明顯的熒光，說明ChR2-tdTomato沒有表達。

2.2 心臟自主搏動小鼠的光控起搏

心肌表達ChR2-tdTomato的αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在連接呼吸機和開胸后，在沒有藍光刺激的情況下，心臟自主搏動的頻率約為4 Hz(圖3：A)；當給予小鼠心臟2 Hz的藍光刺激時，原先的自主搏動節(jié)律被打亂，出現(xiàn)明顯的心律失常(圖3：B)；當藍光刺激頻率與自主搏動頻率相同時，心跳頻率維持在4 Hz(圖3：C)；當使用6 Hz藍光刺激頻率時，心臟搏動完全由光照支配，且表現(xiàn)為竇性心律(圖3：D)；當藍光刺激頻率提高至 8 Hz 時，心跳頻率也隨之變?yōu)? Hz，但出現(xiàn)了短暫的心律失常(圖3：E)；當使用10 Hz的藍光刺激時，小鼠心肌已不能承受快速的去極化，雖然心臟搏動仍較為規(guī)律，但心電圖波形已出現(xiàn)嚴重的紊亂(圖3：F)。當撤除藍光刺激之后，無論之前使用了何種刺激頻率，小鼠心臟均可迅速恢復到4 Hz的自主搏動狀態(tài)。

2.3 心臟停跳小鼠的光控起搏

為了檢測因缺血損傷而無法自主搏動的心臟對藍光刺激的反應，本研究將αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠麻醉后不連接呼吸機直接開胸，待心臟停跳后進行藍光刺激，當刺激頻率為1～5 Hz時，藍光刺激可以有效引發(fā)小鼠心臟的搏動，搏動頻率與刺激頻率完全一致(圖4：A～C)。當藍光刺激頻率為7.5～10 Hz時，由于可能存在的心肌損傷，小鼠心率僅能維持在4～5 Hz內(nèi)，無法進一步提高(圖4：D～F)。以上結(jié)果說明光遺傳學技術(shù)具有起搏停跳心臟的能力，起搏效果可能與心肌損傷的程度密切相關(guān)。

2.4 對照小鼠對藍光刺激無響應

為了確認αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心臟的光控起搏是由心肌表達的ChR2引發(fā)的，本研究還對αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+2種不表達ChR2-tdTomato的對照小鼠進行了同樣的實驗，發(fā)現(xiàn)2種小鼠對5 Hz和10 Hz的藍光刺激均沒有響應，心率一直維持在6 Hz(圖5)，這說明ChR2的表達是心臟光控起搏的決定因素。

3 討論

光遺傳學是一種新興的通過光敏感生物元件來控制生物學功能的技術(shù)手段，目前已被廣泛應用于神經(jīng)科學研究中，極大地促進了更為精細的神經(jīng)元分類、投射和功能研究(Rajasethupathyetal.，2016)。然而，目前在心臟電生理研究中光遺傳學的應用還較少，Arrenberg等(2010)在斑馬魚Daniorerio上實現(xiàn)了心臟節(jié)律的光遺傳學控制，借助黃光激活的陰離子通道halorhodopsin(NpHR)(Schobert &Lanyi，1982)和藍光激活的ChR2成功構(gòu)建了心動過速、心動過緩、房室傳導阻滯和心臟驟停等疾病模型。同時，ChR2也被證明可以在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)光控心臟起搏(Bruegmannetal.，2010)。在體外培養(yǎng)的人誘導多能干細胞分化的心肌細胞上聯(lián)合使用ChR2與遺傳編碼的鈣離子和膜電位熒光探針，可以實現(xiàn)心肌細胞的起搏及鈣瞬變和膜電位同步記錄，從而進行高通量的藥物心臟毒性檢測(Dempseyetal.，2016)。除了直接對心肌細胞進行光遺傳學操控，在交感神經(jīng)上表達ChR2并進行光刺激可以使離體的小鼠心臟的搏動加快、收縮增強，更易發(fā)生心律失常(Wengrowskietal.，2015)。與之相對，在交感神經(jīng)上表達光驅(qū)動的質(zhì)子外流泵ArchT(Hanetal.，2011)，可以顯著抑制交感神經(jīng)的興奮并保護動物免于發(fā)生心律失常(Yuetal.，2017)。另外，利用光遺傳學技術(shù)，心臟浸潤的巨噬細胞也被發(fā)現(xiàn)在心臟電活動傳導尤其是房室傳導過程中發(fā)揮著重要作用(Hulsmansetal.，2017)。

利用心肌組織特異性表達ChR2的轉(zhuǎn)基因小鼠，本研究也對使用光遺傳學技術(shù)進行心臟節(jié)律控制進行了探討，不僅驗證了藍光刺激ChR2對正常狀態(tài)小鼠心臟的精準調(diào)控，還對因缺血損傷停止搏動的小鼠心臟進行了不同頻率的起搏測試，發(fā)現(xiàn)短時停跳的心臟在藍光刺激下也有產(chǎn)生搏動的能力。由于本研究使用的LED藍光刺激器光斑較大，無法將照射范圍控制在心臟局部較小范圍，未能比較對竇房結(jié)、心房、心室等不同部位進行藍光刺激的效果差異，這是本研究的一個重要局限，在后期研究中可以通過使用光斑較小的激光光源進行多部位刺激和更深入的探討。此外，伴隨單細胞測序技術(shù)的廣泛應用，越來越多的心肌細胞亞型也已被發(fā)現(xiàn)(Zhou &Zhang，2020)，構(gòu)建并使用各細胞亞型特異性的Cre小鼠結(jié)合ChR2光遺傳學刺激(Wangetal.，2017)，將有助于理解各亞型心肌細胞的電生理特性差異，是深入理解心臟功能和心律失常的發(fā)生機制的重要技術(shù)手段。