2型糖尿病相關靜脈橋內膜增生的動物模型建立與機制分析

李波，劉長城，李海明，戴龍圣，顧承雄

冠心病三支病變合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)首選冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting, CABG)治療，大隱靜脈橋是CABG應用最多的橋血管材料[1-2]。然而，研究顯示T2DM顯著增加CABG術后靜脈橋閉塞風險[3]。目前研究已證實糖尿病微血管病變(視網膜病、腎病和神經病變)與高血糖、胰島素抵抗和高胰島素血癥密切相關[4]，但是T2DM相關的橋血管病變機制仍未完全闡明。盡管積極應用降糖策略維持正常的血糖水平，T2DM患者CABG術后5年和10年生存率仍顯著低于無T2DM患者，并且死亡風險增加2倍[5]。所以，高血糖并不是T2DM患者心血管病風險增加的惟一決定因素。因此，建立可靠的動物模型，探究T2DM導致橋血管病變的病理生理異常機制意義重大。本研究確立了一種可靠、重復性強的T2DM相關靜脈橋內膜增生的動物模型建立方法，初步探討了T2DM導致靜脈橋病變的病理生理機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與建模 2019年9—11月于北京安貞醫(yī)院動物實驗室進行實驗。新西蘭雄性大白兔36只，體質量2.5～3.5 kg(購買于北京芳緣養(yǎng)殖廠)。整個研究過程均普通喂養(yǎng)。將實驗兔隨機數字表法分為2組：T2DM組24只，對照組12只。

T2DM模型建立具體方法：將鏈脲佐菌素(Sigma公司，美國)溶解于4℃冰箱預冷pH 4.2的0.1 mol/L檸檬酸鈉—檸檬酸緩存液中，配成25 mg/ml的鏈脲佐菌素溶液(每次現配現用，配制30 min內用完)。T2DM組模型兔禁食12 h, 用3%戊巴比妥鈉鹽溶液(1 ml/kg)經耳緣靜脈緩慢注射進行麻醉后，將鏈脲佐菌素溶液按50 mg/kg劑量經耳緣靜脈注射，3 d和6 d后分別再次注射等劑量溶液，之后每2周測量一次空腹血糖，連續(xù)2次血糖>11.1 mmol/L視為建模成功[6]。而對照組只注射等體積的檸檬酸鈉—檸檬酸緩存液。

1.2 頸動脈旁路移植術方法 誘發(fā)T2DM 4周后，2組實驗兔均行頸動脈旁路移植術，術前6 h禁食水。麻醉同前，用“No-touch”法游離一側頸外靜脈。500 U/kg普通肝素全身肝素化后，用血管吻合輪(新華手術器械有限公司，山東淄博)將3 cm長頸外靜脈離斷后端—端吻合于原位頸動脈之間，建立兔頸動脈旁路移植模型，詳細方法見參考文獻[7]。

1.3 觀察指標與方法 移植4周后，獲取靜脈橋，同時在對照組未靜脈移植側獲取正常頸外靜脈，作為空白對照組。(1)靜脈組織結構觀察：所有靜脈組織進行HE和Masson染色，觀察各組靜脈橋組織結構；(2)靜脈橋組織細胞因子檢測：采用免疫組化染色和Western-blot法檢測白介素6 (IL-6)和血管細胞黏附分子1(VCAM-1)蛋白表達，所用抗體分別為抗IL-6抗體 ab9324、抗VCAM-1抗體ab98954(Abcam,UK)。

2 結 果

2.1 造模情況 T2DM組中24只兔有20只成功誘發(fā)T2DM，3只給藥后飼養(yǎng)期間死亡，1只給藥后血糖值未達診斷標準；頸動脈旁路移植后，其中1只麻醉意外死亡，1只移植后2周死亡，最終18只靜脈橋合并T2DM的模型兔成功存活4周，而對照組12只均成功存活4周。

2.2 2組靜脈組織結構比較 移植4周后，T2DM組靜脈橋病理重構程度顯著高于對照組。HE染色顯示T2DM組靜脈橋的炎性細胞浸潤顯著增多，Masson染色示T2DM組血管平滑肌層結構紊亂，且內膜層增厚比對照組顯著(圖1)；T2DM組靜脈橋內膜增厚顯著大于對照組[(137.8±19.2) μm vs.(116.2±15.5) μm,t=3.249,P=0.003)]。

2.3 靜脈橋組織細胞因子比較 免疫組化染色顯示T2DM組靜脈橋的IL-6和VCAM-1染色顯著多于對照組(圖2)，而且Western-blot蛋白檢測也顯示T2DM組靜脈橋IL-6和VCAM-1蛋白表達量顯著高于對照組(IL-6：12.5±2.2vs.7.8±1.4,t=6.549,P<0.001;VCAM-1：48.3±7.9vs.22.1±5.6,t=9.921,P<0.001)，見圖3。

圖3 2組IL-6、VCAM-1蛋白電泳結果

3 討 論

建立可靠的T2DM合并靜脈橋內膜增生的動物模型對研究T2DM相關的橋血管病變機制至關重要。目前，國內最常用小鼠誘發(fā)T2DM模型，然而小鼠周圍血管細小，建立動脈旁路移植模型存在技術困難，可重復性較差，所以本研究選用兔誘發(fā)T2DM并行頸動脈旁路移植。鏈脲佐菌素和四氧嘧啶是國內外最常用的化學損傷誘導DM的藥物。與四氧嘧啶比較，鏈脲佐菌素對肝腎功能損傷小，建模容易存活，對胰島β細胞具有高度選擇性。上述兩種藥物建立兔DM模型經靜脈注射給藥劑量范圍為40～150 mg/kg，二者建模成功率無顯著差別[6]。所以本研究選用鏈脲佐菌素50 mg/kg，共給藥3次，每次間隔3 d，誘發(fā)T2DM。研究表明，一次性大劑量給藥，直接導致胰島β細胞廣泛壞死，容易誘發(fā)T1DM；而多次小劑量給藥，只破壞部分胰島β細胞，并造成周圍組織對胰島素不敏感，容易誘發(fā)T2DM[8]。 對于使用頸外靜脈行頸動脈旁路移植，筆者選擇血管吻合輪，而非縫線直接縫合。吻合輪內徑固定(1.5 mm)，無縫線吻合相關吻合口狹窄風險，容易操作，也可保障旁路移植手術的安全性和一致性。本研究結果證實，建立兔T2DM相關靜脈橋再狹窄模型的方法效果可靠，可重復性強。

圖1 3組兔頸靜脈橋HE和Masson染色結果(×100)

注：A.T2DM組血管IL-6表達；B.T2DM組VCAM-1表達；C.對照組血管IL-6表達；D.對照組VCAM-1表達

以往研究表明，控制血糖本身不能顯著降低心血管事件風險[9-12]。本研究中模型動物正常喂養(yǎng)，未控制血糖。移植4周后，靜脈橋病理觀察發(fā)現，T2DM顯著增加血管壁中炎性細胞浸潤，這表明T2DM加重靜脈橋炎性反應，進而促進靜脈橋內膜增生。該結果與Zhang 等[13]研究豬模型發(fā)現糖尿病在冠狀動脈中誘發(fā)炎性反應的結果相一致。

筆者進一步分析了T2DM相關靜脈橋病變的分子機制。T2DM可促進致炎性細胞因子IL-6和VCAM-1在靜脈橋中的大量表達。大量研究證據表明，T2DM可損傷血管內皮細胞(endothelial cell, EC)和平滑肌細胞(smooth muscle cell, SMC)功能[14-16]。VCAM-1是細胞黏附分子超家族成員，在血管損傷刺激下主要由EC和SMC大量分泌，并黏附白細胞，促進血管炎性反應[17-18]。動物模型研究表明，應用單克隆抗體阻斷VCAM-1生物活性，可顯著緩解血管內膜增生[19-20]。

IL-6是重要的致炎因子，不僅可促進細胞黏附分子合成，而且可誘導SMC增殖并分泌基質金屬蛋白酶，后者可分解細胞外基質，促進SMC向內膜下遷移，最終導致內膜增生[21]。研究表明T2DM患者血漿IL-6水平較無T2DM患者高2～3倍[22]。 Xiang等[23]發(fā)現IL-6高表達與CABG術后靜脈橋病變密切相關。當前研究表明，IL-6可通過JAK/STAT、ERK1/2和PI3K等多種信號分子通路調控細胞病理生理活動[24]。

盡管本研究結果表明，T2DM可通過調控致炎因子IL-6和VCAM-1的表達影響靜脈橋病變，但是T2DM通過何種信號分子通路機制發(fā)揮作用，仍然需要使用T2DM相關靜脈橋病變模型進行深入的基礎研究來闡明，這對尋找新的干預靶點意義重大。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李波、劉長城：論文撰寫，論文修改；李海明：數據分析；戴龍圣：研究實施；顧承雄：研究設計，論文審核