SHH信號(hào)通路激活對(duì)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷血管再生作用研究

國偉，楊軍，任法新，梁平平

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic-reperfusion injury，MIRI)是心肌長時(shí)間缺血重新恢復(fù)血液灌注后出現(xiàn)的一種損傷，其特點(diǎn)是更為明顯和嚴(yán)重的損害或功能障礙，包括心肌收縮功能障礙、冠狀動(dòng)脈血流和血管反應(yīng)性的變化。目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，也無預(yù)防及治療的有效藥物[1-2]。因此，探討MIRI的深層發(fā)病機(jī)制和臨床研發(fā)靶向治療藥物具有重大意義。近年來，SHH(sonic hodgehog)信號(hào)通路對(duì)心血管系統(tǒng)疾病的影響越來越受到人們的重視，其為探索保護(hù)心肌細(xì)胞功能提供了新的作用靶點(diǎn)[3]。研究還發(fā)現(xiàn)，SHH信號(hào)通路參與了多種缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭械难茉偕?，包括腦、角膜、骨骼肌缺血及肢體缺血模型等[4-5]。然而，SHH信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中的研究很少?；诖耍F(xiàn)探討SHH信號(hào)通路激活對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)缺血再灌注損傷促進(jìn)血管再生的潛在作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： SD大鼠(雄性)，月齡1月，體質(zhì)量100～150 g，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(魯)2016-0016，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，日常光照，自然飲水。 (2)試劑：10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液購于美國Invitrogen公司，無L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，Cyclopamin購于美國Sigma-Alidrich公司，重組人SHH蛋白購于美國Cambridge公司，ELISA試劑盒購于武漢Antigene公司，Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司，SMA 400 UV0VIS購于上海Merinton公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購于美國Rochford公司，TM型cDNA合成試劑盒購于美國Bio-Rad公司。(3)儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀(日本Olympus公司，型號(hào)AU400)， Bio-Image(Bio-Rad)圖像分析軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2016年7月—2017年2月于青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 大鼠原代心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：參照參考文獻(xiàn)[6]，CMECs來源于SD雄性大鼠心臟組織，大鼠腹腔內(nèi)注射0.1%戊巴比妥鈉(2 ml/100 g)麻醉，無菌條件下迅速取出心臟，并用PBS液洗凈3遍，去除大血管、瓣膜及結(jié)締組織，剪去右心室和左、右心房，將左心室浸泡在75%酒精中10 s，然后將心肌組織剪碎成塊，1 mm3大小，并加入0.025%胰酶水浴(溫度37℃)中消化10 min，再用100 mm尼龍網(wǎng)濾除未消化左心室心肌組織，繼而用含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液將沉淀反復(fù)混勻，然后用1 ml的吸管軟柔吹打3次。將所得左心室細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，6 h后倒出培養(yǎng)液去掉未貼壁的平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，再加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，孵育48 ～72 h后更換1次培養(yǎng)液，獲取原代細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施：選取培養(yǎng)7 d的CMECs建立體外氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)損傷模型用以模擬心肌缺血再灌注損傷，參照文獻(xiàn)[7]具體操作如下：CMECs用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，然后在無血清培養(yǎng)基的OGD條件下培養(yǎng)，并置于無糖或無L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2氧糖剝奪條件下培育CMECs 1 h；再從缺氧條件下取出CMECs培養(yǎng)板,用PBS緩沖液洗3 次，然后在正常氧條件下孵育CMECs 1.5 h。

實(shí)驗(yàn)分組： (1)正常對(duì)照組(Control，C組)：CMECs不給予任何外部因素處理；(2)C+SHH組：CMECs在正常氧條件下孵育1 h后，加入人重組SHH蛋白3 μg/ml正常孵育1.5 h；(3)C+CYC(環(huán)杷明，Cyclopamine， CYC)組：CMECs在正常氧條件下孵育1 h后，加入CYC(SHH信號(hào)通路抑制劑)20 μmol/L正常孵育1.5 h； (4)OGD組：CMECs給予OGD/R，即缺血1 h，再灌注1.5 h；(5) OGD+SHH組：CMECs缺血1 h后，加入含人重組SHH蛋白3 μg/ml的再灌液再灌注1.5 h；(6)OGD+CYC組：CMECs缺血1 h后，加入含CYC 20 μmol/L的再灌液再灌注1.5 h。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 MTT法測(cè)定CMECs細(xì)胞活力：CMECs以5×104/ml細(xì)胞密度接種在96孔板上，每孔200 μl。細(xì)胞以SHH蛋白(3 μg/ml)、CYC(20 μmol/L)處理后各組在相應(yīng)正常氧或OGD/R條件下孵育48 h,然后以12 000 r/min離心去除上清液。每個(gè)孔再加入MTT 20 μl并培養(yǎng)4 h,繼而每個(gè)孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl震蕩混勻10 min；使每個(gè)孔的細(xì)胞結(jié)晶物得到充分溶解后，再用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長為570 nm處測(cè)定各個(gè)孔的吸光度值(OD值)。

1.3.2 ELISA法測(cè)定血清血管新生因子VEGF、FGF和Ang-1水平：將50 μg/ml的VEGF、 FGF和Ang-1抗體涂在預(yù)處理的微孔板上，置37℃水浴箱中溫育2 h。4℃孵化過夜后，微孔板用含0.05% Tween-20 (PBST) 的PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍，封閉在5%山羊血清PBST中1 h。然后樣本用含10%小牛血清和5%山羊血清的PBST按1∶100稀釋，再用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG在37℃水浴箱中孵育2 h。最后，用1 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm吸光度值。

1.3.3 RT-PCR法測(cè)定血管生長因子VEGF、FGF和Ang-1 mRNA表達(dá)水平：各項(xiàng)干預(yù)結(jié)束后，提取細(xì)胞總RNA，參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。遵循SYBR Green熒光染料技術(shù)(SYBR Green Master mix; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，從而獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在每一次聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，確認(rèn)只有一個(gè)樣品被擴(kuò)增和檢測(cè)。其中，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析Ct值。Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到系統(tǒng)設(shè)定的有目的DNA合成時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。mRNA表達(dá)的差異采用相對(duì)定量法比較, 即以2-△△Ct表示待測(cè)標(biāo)本的相對(duì)mRNA水平,其中△Ct =(目的基因Ct值-看家基因平均Ct值)。

1.3.4 Western-blot檢測(cè)SHH、SMO、Patched-1、Gli-1和Gli-2蛋白表達(dá)：用M-PER哺乳動(dòng)物蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，在臨用前加入以下試劑: DTT 0.5 mmol/L,PMSF 0.5 mmol/L,aprotinin 10 μg/ml，12 000 r/min離心15 min棄去沉淀，測(cè)定蛋白濃度，每組取30 μg進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，采用Bio-Image(Bio-Rad)圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶采集信號(hào)并分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白IA值/內(nèi)參蛋白IA值。其中，條帶測(cè)定值以積分吸光度值(IA)表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組CMECs細(xì)胞活力比較 與C組 CMECs細(xì)胞活力(0.86±0.12，n=10)比較， C+SHH組CMECs細(xì)胞活力(1.21±0.45，n=10)顯著增加(t=1.996,P<0.05)，C+CYC組(0.64±0.19，n=10)顯著降低(t=1.988,P<0.05)；與C組細(xì)胞活力比較,OGD組細(xì)胞活力(0.41±0.07，n=10)顯著減弱(t=1.972,P<0.05)；與OGD組細(xì)胞活力比較，OGD+SHH組(0.83±0.10，n=10)顯著增加(t=2.004，P<0.05)，OGD+CYC組(0.23±0.05，n=10)顯著降低(t=2.212,P<0.05)，見圖1。

注：與C組比較，a P<0.05；與 OGD組比較，b P<0.05

2.2 各組血清血管新生因子VEGF、FGF、Ang-1蛋白水平(pg/ml)比較 與C組血清VEGF、FGF和Ang-1水平(71.23±3.57,50.36±2.18,62.48±3.03,n=10)比較，C+SHH組(108.50±6.05,118.95±6.47,125.71±6.92,n=10)顯著增加(t=1.990,2.072,2.001,P<0.05)，C+CYC組(50.06±2.73,32.42±1.95,41.59±2.04,n=10)顯著降低(t=7.435,5.969,3.826,P<0.01);與C組血清VEGF、FGF和Ang-1水平比較,OGD組(35.19±2.01,15.47±0.94,20.86±1.27,n=10)顯著降低(t=10.009,7.763,8.684,P<0.01)；與OGD組血清VEGF、FGF和Ang-1水平比較，OGD+SHH組(69.85±3.26,48.45±2.20,63.24±3.15,n=10)顯著增加(t=12.394,10.871,8.375,P<0.01)，OGD+CYC組(24.83±1.58,8.13±0.51,8.90±0.68,n=10)顯著降低(t=2.128,2.003,2.370,P<0.05)，見圖2。

2.3 各組血管新生因子VEGF、FGF、Ang-1 mRNA表達(dá)比較 與C組VEGF、FGF和Ang-1的mRNA表達(dá)水平(1.00±0.05,1.00±0.06,1.00±0.04,n=10)比較，C+SHH組(1.52±0.64,1.68±0.53,1.76±0.75,n=10)顯著增加(t=2.043,2.125,1.990,P<0.05)，C+CYC組(0.86±0.51,0.74±0.48,0.82±0.49,n=10)顯著降低(t=3.507,4.427,3.072,P<0.01);與C組VEGF、FGF和Ang-1的mRNA表達(dá)水平比較,OGD組(0.43±0.27,0.40±0.23,0.48±0.28,n=10)顯著降低(t=8.462,4.017,3.002，P<0.01)；與OGD組VEGF、FGF和Ang-1的mRNA表達(dá)水平比較，OGD+SHH組(1.36±0.58,1.25±0.50,1.28±0.55,n=10)顯著增加(t=5.760,7.396,9.088,P<0.01)，OGD+CYC組(0.31±0.09,0.33±0.07,0.30±0.05,n=10)顯著降低(t=1.973,2.016,1.992,P<0.05)，見圖3、4。

2.4 各組SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與OGD組SHH、SMO、Patched-1、Gli-1、Gli-2的蛋白表達(dá)水平(1.00±0.34,1.00±0.36,1.00±0.39,1.00±0.37,1.00±0.43,n=10)比較,OGD+SHH組SHH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平(2.46±0.42,2.09±0.45,2.24±0.56,1.56±0.39,2.13±0.47,n=10)顯著增加(t=4.517,3.007,3.472,3.726,4.988,P<0.01)；OGD+CYC組(0.59±0.15,0.55±0.17,0.53±0.14,0.72±0.11,0.46±0.09,n=10)顯著降低(t=18.978,19.034,17.152,14.747,16.273,P<0.01)，見圖5、6。

圖4 不同組別CMECs中VEGF、FGF、Ang-1的mRNA表達(dá)

圖6 各組SHH、Patched-1、SMO、Gli-1、Gli-2的蛋白表達(dá)比較

3 討 論

SHH在人體組織細(xì)胞中分布最為廣泛，參與基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和功能蛋白表達(dá)，在調(diào)控胚胎生長發(fā)育、血管新生、腫瘤細(xì)胞增殖等方面有極其重要的作用[8-10]。在大鼠腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血使SHH信號(hào)通路發(fā)生激活，給予該信號(hào)通路特異性抑制劑Cyclopamine后，卻進(jìn)一步加重了腦缺血后神經(jīng)功能的損傷，同時(shí)也加重了腦梗死面積及腦水腫的程度[11]。心肌缺血時(shí)，SHH的表達(dá)水平增加，促進(jìn)骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞誘發(fā)血管生成,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和血管生成素的表達(dá)增多[12]。但是SHH信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。 梁關(guān)鳳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，激活SHH通路可抑制ATM磷酸化改善缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞DNA損傷，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡。本研究表明，在OGD/R條件下，加入外源性重組人SHH蛋白后，CMECs的細(xì)胞活力顯著增加，同時(shí)，血清血管新生相關(guān)因子VEGF、FGF和Ang-1蛋白水平和mRNA表達(dá)也顯著增加；并且SHH信號(hào)通路下游信號(hào)蛋白SHH、SMO、 Patched-1、Gli-1和Gli-2的蛋白表達(dá)水平也顯著增加，但上述指標(biāo)均可被SHH信號(hào)通路的特異性抑制劑Cyclopamine所抑制。因此，本研究初步揭示了SHH信號(hào)通路在CMECs缺血再灌注損傷后血管再生中發(fā)揮著重要作用。近年來眾多研究表明，SHH信號(hào)通路在各種組織和器官的血管再生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并且發(fā)現(xiàn)可能是通過SHH/SMO/Gli通路、磷酸肌醇3-激酶通路及Coup-TFII通路3種途徑來實(shí)現(xiàn)其對(duì)血管再生的調(diào)控[14]。但到目前為止，對(duì)于SHH信號(hào)通路在血管再生中的具體作用機(jī)制仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，加入外源性重組人SHH蛋白可能通過激活SHH-Patched-SMO-Gli信號(hào)通路發(fā)揮促血管再生作用，從而對(duì)CMECs缺血再灌注損傷起到保護(hù)功能。

注：與C組比較，a P<0.05,b P<0.01；與OGD組比較，c P<0.05,d P<0.01

注：與C組比較，a P<0.05,b P<0.01；與 OGD組比較，c P<0.05,d P<0.01

注：與OGD組比較，a P<0.05,b P<0.01

VEGF是作用于內(nèi)皮細(xì)胞糖基化的有絲分裂原，有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括介導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性增加，促進(jìn)血管新生和抑制細(xì)胞凋亡等。Ang-1是促進(jìn)血管形成與成熟的重要血管新生因子。FGF具有廣泛的有絲分裂和細(xì)胞生存活力，并且參與了多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、腫瘤生長和侵襲。Infante等[15]在角膜和后肢缺血模型中研究SHH激活對(duì)血管生成的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入外源重組人SHH蛋白會(huì)使成年小鼠血管和心臟的Patched-1表達(dá)增多，并促使多種血管新生因子(如VEGF、Ang-1和Ang-2)表達(dá)的上調(diào)。Spence等[16]在研究雞胚胎視網(wǎng)膜的血管再生情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，SHH信號(hào)通路激活可以導(dǎo)致FGF表達(dá)增多。Omitz等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SHH可以通過激活硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，HSPGs)促使bFGF表達(dá)上調(diào)，繼而發(fā)揮保護(hù)心肌免受缺血損傷的功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入外源性重組人SHH蛋白可以激活SHH信號(hào)通路，從而進(jìn)一步上調(diào)血管新生因子VEGF、 FGF和Ang-1在CMECs缺血再灌注損傷后的表達(dá)，繼而發(fā)揮促進(jìn)血管新生的重要作用。但是SHH信號(hào)通路在CMECs缺血再灌注損傷后如何調(diào)控血管新生因子VEGF、FGF和Ang-1的表達(dá)，以及其調(diào)控血管新生的潛在具體分子生物學(xué)機(jī)制仍需以后實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，SHH信號(hào)通路激活可以通過增強(qiáng)細(xì)胞活力，上調(diào)血清血管新生相關(guān)因子VEGF、FGF和Ang-1的表達(dá)，從而在缺血再灌注損傷CMECs血管再生過程中起重要作用。隨著科學(xué)研究的進(jìn)一步深入，SHH信號(hào)通路很有可能成為治療人類心血管系統(tǒng)疾病的一個(gè)嶄新的突破，將為心肌缺血后的功能恢復(fù)提供重要理論依據(jù)和新的方法指導(dǎo)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

國偉：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施具體研究過程，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文撰寫；楊軍：提出研究思路，論文審核；任法新、梁平平：實(shí)施研究過程，修改論文