芪藶強心膠囊通過TLR4/NF-κB通路減輕大鼠心肌炎性反應及損傷

馬小林,黃政,方存明,胡學俊,劉冰,伍超,龔天奎,丁文龍

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是威脅人類生命健康的常見病和多發(fā)病。隨著急診介入技術的逐漸推廣，急性心肌梗死患者的預后得到了極大改善。然而，仍有相當數(shù)量的急性心肌梗死患者不能得到及時有效地再灌注治療。心肌梗死后大量心肌細胞的丟失導致急性心力衰竭、心源性休克、惡性心律失常、猝死等嚴重并發(fā)癥發(fā)生。心肌梗死后心室重構亦可導致心功能減退和慢性心力衰竭發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應的過度激活可誘導心肌細胞凋亡、壞死，促進心室重構和心力衰竭發(fā)生[1-2]。因此，抑制免疫炎性反應對改善心肌梗死患者心功能和預后具有重要意義。研究證實芪藶強心膠囊能有效抑制心室重構、緩解心力衰竭癥狀并改善心力衰竭預后[3-4]。抑制免疫炎性反應可能是芪藶強心膠囊治療心力衰竭的機制之一?，F(xiàn)觀察芪藶強心膠囊對心肌梗死大鼠心肌Toll樣受體-4(TLR4)/核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路的影響及其對缺血心肌的保護作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)動物：SPF級雄性SD大鼠32只，體質量(230±20)g，購自皖南醫(yī)學院。大鼠在室溫(22±2)℃、濕度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗節(jié)律的環(huán)境下飼養(yǎng)。(2)試藥試劑：芪藶強心膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產)；卡托普利(常州制藥廠生產);青霉素(石藥控股集團有限公司生產) ； 大鼠TLR4、NF-κB p65、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、β-actin抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，HE染色、TUNEL染色試劑盒購自上海碧云天生物公司。(3)儀器設備：小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司，型號ALC-V8S)，心電圖儀(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，型號ECG2250)，顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司，型號IX73]，離心機[艾本德(上海)國際貿易有限公司，型號5804R]，掃膜儀(美國Licor公司，型號Odyssey CLx)。

1.2 實驗方法 2019年4—6月于宣城市人民醫(yī)院病理科進行實驗。 將SD大鼠32只隨機數(shù)字表法分為假手術組、MI組、MI+芪藶強心組、MI+卡托普利組，每組8只。大鼠以1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管成功后連接小動物呼吸機，設置吸呼比1∶2，潮氣量0.7～0.8 ml，呼吸頻率80次/min。于大鼠左胸第3～4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳與肺動脈之間下約1 mm處結扎冠狀動脈。當結扎部位以下心肌變灰白，心電圖肢體導聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬高時提示冠狀動脈結扎成功。迅速縫合切口、關胸。術后3 d予青霉素20萬U/d腹腔注射預防感染。假手術組大鼠手術過程同上，但只穿線不結扎冠狀動脈。將芪藶強心膠囊藥粉以生理鹽水配制成0.1 g/ml濃度溶液。參考林銳波等[5]研究方法，MI+芪藶強心組以芪藶強心膠囊溶液1.2 g·kg-1·d-1，MI+卡托普利組以卡托普利25 mg·kg-1·d-1。假手術組、MI組以生理鹽水10 ml·kg-1·d-1，均每日1次灌胃2周。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 心肌病理學檢測：大鼠給藥2周后采用頸椎脫臼法處死，開胸取心肌梗死區(qū)心肌組織，PBS溶液清洗后以4%多聚甲醛4℃固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片。采用HE染色觀察各組心肌形態(tài)、結構變化及炎細胞浸潤情況，TUNEL染色檢測各組心肌細胞凋亡情況。所有操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 Western-blot檢測TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達：取大鼠心肌組織40 mg加入RIPA裂解液充分勻漿、裂解。裂解液4℃下，離心后吸取上清，采用BCA法測定蛋白濃度；取等量蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗溶液(濃度1∶1 000)中4℃搖勻過夜，再加入二抗溶液室溫孵育2 h；經洗滌、顯影、灰度掃描后，用 Odyssey 3.0軟件對蛋白條帶進行灰度值測定，以目的條帶與β-actin的灰度比值表示TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌結構變化比較 假手術組心肌纖維排列整齊，細胞核大小、形態(tài)一致，心肌間隙正常，無炎性細胞浸潤。MI組心肌纖維排列紊亂，可見心肌纖維斷裂，核深染，心肌間隙明顯增寬，或伴炎性細胞浸潤。與MI組比較，MI+芪藶強心組及MI+卡托普利組心肌纖維排列較為整齊，心肌纖維破壞減輕，心肌間隙減小，炎性細胞浸潤減少，見圖1。

2.2 各組大鼠心肌TLR4、NF-κB蛋白表達比較 Western-blot檢測結果顯示，與假手術組比較，MI組大鼠心肌TLR4、NF-κB p65蛋白表達顯著增多(t=14.951、12.710，P均=0.000)；與MI組比較，MI+芪藶強心組、MI+卡托普利組大鼠心肌TLR4(t=7.536、7.704，P均=0.002)、NF-κB p65(t/P=6.103/0.004、5.398/ 0.006)蛋白表達顯著減少；MI+芪藶強心組、MI+卡托普利組TLR4、NF-κB p65蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見圖2。

2.3 各組大鼠心肌炎性因子表達比較 與假手術組比較，MI組大鼠心肌TNF-α、IL-1β表達量顯著增多(t=19.272、15.140，P均=0.000)；與MI組比較，MI+芪藶強心組、MI+卡托普利組大鼠心肌TNF-α(t=6.660、6.710，P均=0.003)、IL-1β表達量顯著減少(t/P=6.655/0.003、5.323/0.006)；MI+芪藶強心組、MI+卡托普利組TNF-α、IL-1β表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見圖2。

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡比較 正常心肌細胞核TUNEL染色呈淡藍色，細胞核大小、形態(tài)較為一致。

注：A.假手術組；B.MI組；C.MI+芪藶強心組；D.MI+卡托普利組

凋亡心肌細胞核TUNEL染色呈棕色或棕褐色,細胞核大小不一，核內染色質皺縮呈藍色顆粒狀位于核膜下，見圖3；假手術組心肌組織中可見極少量凋亡細胞(4.37±0.49)%，MI組心肌細胞凋亡率(48.97±2.35)%，較假手術組顯著升高(t=18.548，P=0.000)；與MI組比較，MI+芪藶強心組心肌細胞凋亡率(32.03±1.94) %顯著降低(t=5.548，P=0.005)；MI+芪藶強心組與MI+卡托普利組心肌細胞凋亡率(33.57±1.71)%比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

心肌細胞凋亡、壞死及免疫炎性反應的過度激活是心肌梗死后心力衰竭的重要發(fā)病機制。因此，保護缺血心肌、抑制炎性反應對心肌梗死后心力衰竭的防治具有重要意義。芪藶強心膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡病理論研制的中藥復方制劑，具有益氣溫陽、活血通絡、利水消腫之功效，對心肌梗死后心力衰竭具有較好療效，但其具體藥理機制仍有待闡明。本研究從免疫炎性反應角度探討芪藶強心膠囊對心肌梗死后心肌的保護作用及機制。研究結果提示，芪藶強心膠囊可能通過TLR4/NF-κB信號通路減輕心肌梗死大鼠心肌免疫炎性反應和結構損傷。

心肌梗死后心肌缺血、缺氧導致心肌細胞結構、功能損傷。受損細胞釋放的損傷相關分子模式可與Toll樣受體、補體等模式識別受體結合，啟動天然免疫應答，誘導炎性因子釋放和炎性反應[6]。TNF-α、IL-1β等炎性因子在梗死區(qū)心肌表達增多，可誘導心肌細胞凋亡、壞死，促進心肌纖維化和心室重構[7-8]。有研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎性因子表達水平與心肌梗死患者的心功能、危險分層及預后密切相關[9]。芪藶強心膠囊能夠降低慢性心力衰竭患者血清炎性因子表達，改善心臟功能[10]。然而，芪藶強心膠囊對梗死心肌局部炎性因子的表達是否具有調節(jié)作用，目前鮮有研究報道。本研究中，MI+芪藶強心組心肌TNF-α、IL-1β表達較MI組顯著減少，心肌細胞凋亡及心肌結構損傷明顯減輕，提示芪藶強心膠囊可能通過抑制心肌免疫炎性反應參與對缺血心肌的保護。

注：A.假手術組；B.MI組；C.MI+芪藶強心組；D.MI+卡托普利組

注：A.假手術組；B.MI組；C.MI+芪藶強心組；D.MI+卡托普利組

目前，芪藶強心膠囊抑制梗死心肌免疫炎性反應的具體機制仍不十分明確。Han等[11]研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強心膠囊能夠抑制TGF-β1/Smad3及NF-κB信號通路，減少心肌梗死大鼠心肌TNF-α、IL-6表達，減輕心肌纖維化和心室重構。Fu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強心膠囊較貝那普利更顯著改善心肌梗死大鼠心力衰竭標志物水平，并增加心肌保護性蛋白血管生成素樣4表達，降低炎性反應相關的脂蛋白和溶血磷脂酸水平，通過調節(jié)心肌免疫炎性反應過程改善心臟功能。另外，芪藶強心膠囊的多個組方成分如人參、丹參、葶藶子、黃芪等均被證實可通過多種機制調節(jié)心肌炎性因子表達[13-15]。因此推測，芪藶強心膠囊抑制心肌免疫炎性反應的機制可能與其對復雜炎性反應網(wǎng)絡的多方面調控有關。

TLR4/NF-κB是經典的炎性反應信號轉導通路，其激活后可促進下游炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等表達，從而誘導免疫炎性反應和靶細胞凋亡、壞死[16]。TLR4在心肌組織中高表達，TLR4及其相關信號轉導通路已被許多研究證實參與心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病和進展[17-18]。芪藶強心膠囊能否作用于TLR4/NF-κB信號通路并減輕其介導的心臟免疫炎性反應和心肌損傷，目前尚無報道。在本研究中，MI組大鼠心肌TLR4、NF-κB表達顯著增多，而MI+芪藶強心組TLR4、NF-κB表達較MI組顯著減少，提示芪藶強心膠囊可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕心臟免疫炎性反應和心肌細胞凋亡，從而對缺血心肌發(fā)揮保護作用。

ACEI/ARB類藥物是預防心肌梗死后心室重構和心力衰竭的常用藥物。除抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)外，ACEI/ARB類藥物還具有抗炎、抗氧化、血管內皮保護、延緩動脈粥樣硬化進展、調節(jié)血管纖維蛋白溶解平衡、抗血小板凝集等多重心血管保護作用。本研究比較了芪藶強心膠囊與卡托普利在調節(jié)心肌梗死大鼠心肌炎性反應和損傷中的作用。結果發(fā)現(xiàn)，MI+芪藶強心組與MI+卡托普利組在TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達方面無顯著差異，提示芪藶強心膠囊對梗死心肌免疫炎性反應的調節(jié)作用可能不劣于卡托普利，但仍有待臨床研究證實。

綜上所述，芪藶強心膠囊通過抑制免疫炎性反應，減輕心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和心肌結構損傷；芪藶強心膠囊的抗炎、抗凋亡作用可能與其抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

馬小林：課題設計，統(tǒng)計分析，論文撰寫；黃政：課題設計，參與撰寫；方存明：選擇課題，論文修改、審核；胡學俊、劉冰、伍超、龔天奎、丁文龍：研究實施，數(shù)據(jù)獲取