負(fù)載磁性氧化鐵納米粒子的脂質(zhì)體的制備及評(píng)價(jià)

金哲浩，崔云秋，孫景鑫，金光玉，全姬善*

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 影像一科， 吉林 延吉 133002； 2.延邊大學(xué) 藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

福爾馬林、烏拉坦、多聚甲醛、抗壞血酸、六水三氯化鐵和四水氯化鐵均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸羥胺、氯仿、甲醇、鄰二氮菲、鉬酸銨、無(wú)水醋酸鈉、濃硫酸、高氯酸、乙酸、二甲苯、無(wú)水乙醇、硝酸鐵(Ⅲ)九水合物、氨水、硝酸和二甲基亞砜均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；膽固醇，美國(guó)Avanti公司；蛋黃卵磷脂、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE -PEG2000)，日本精化株式會(huì)社；四甲基偶氮唑藍(lán)，碧云天生物技術(shù)研究所； DMEM培養(yǎng)基、胰酶消化液，美國(guó)HyClon公司； RPMI -1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibico公司；胎牛血清，以色列BI公司； Sephadex G -50，美國(guó)Sigma -Aldrich公司；透析袋，美國(guó)光譜公司；蘇木素(hematoxylin)、伊紅(eosin)聯(lián)合染色液(HE染色液)，上海源葉生物科技有限公司；普魯士藍(lán)試劑盒、中性樹(shù)膠、磷酸緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)，索萊寶科技有限公司；石蠟，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

BALB/c雌性裸鼠(5周齡)，在無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)的條件下飼養(yǎng).SPC -A1細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、HepG2細(xì)胞和SMMC -7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司.在培養(yǎng)箱(37 ℃，二氧化碳的體積分?jǐn)?shù)為5%)內(nèi)培養(yǎng)上述細(xì)胞，培養(yǎng)基中均加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素和鏈霉素.SPC -A1細(xì)胞和SMMC -7721細(xì)胞的培養(yǎng)基為RPMI， HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BL -90 Plus型Zeta電位用粒度分析儀，美國(guó)Brookhaven儀器公司；超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；X射線衍射儀，荷蘭PANnlytical公司；Virtis臺(tái)式冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SP Scientific公司；臨床3.0 T核磁共振掃描儀，德國(guó)西門(mén)子股份公司； U-1900型光束分光光度計(jì)，日本HITACHI有限公司；DW -86L80型超低溫保存箱，浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司；熒光電子顯微鏡，日本Olympus有限公司；RCZ -6B3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海黃海藥檢有限公司； DZF -6050型真空干燥箱，廣州市深華生物技術(shù)有限公司；Vortex2圓周振蕩器，德國(guó)IKA公司.

1.3 MION-LP的制備

參考文獻(xiàn)[5]的方法合成MION.將1.960 8 g六水三氯化鐵、0.718 g四水氯化鐵溶于超純水中，然后將其加入到由氮?dú)獗Ｗo(hù)的三口燒瓶中，并在攪拌下迅速注入4.8 mL氨水，反應(yīng)30 min；將永久磁鐵置于燒瓶下，靜置，待上述體系分層后去除上清液；用超純水多次清洗磁鐵吸附物至清洗液pH=7;分離清洗液后在所得到的沉淀物中加入 0.1 mol·L-1的硝酸溶液(酸化)，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)和高速磁力攪拌下加入硝酸鐵(Ⅲ)九水合物溶液；加熱回流1 h(溶液顏色由棕黑色變成黃褐色)后去除上清液，并用超純水將磁鐵吸附物轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量為6 000～8 000的透析袋中；以0.01 mol·L-1的硝酸溶液作為透析液對(duì)所得沉淀物透析2 d即得MION.

參考文獻(xiàn)[6]的方法制備MION -LP.將1.4 mg膽固醇、20.0 mg卵磷脂和3.6 mg DSPE -PEG2000溶于氯仿-甲醇(體積比為2∶3)中，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑得磷脂膜；將裝有磷脂膜的旋蒸瓶置于真空干燥箱內(nèi)(40 ℃)干燥12 h，然后加入MION水溶液，并于40 ℃水浴條件下水化脫膜30 min；冰浴下利用超聲波細(xì)胞粉碎儀的探針對(duì)水化液進(jìn)行超聲15 min，過(guò)濾(0.22 μm微孔濾膜)后即得MION -LP，并保存(4 ℃)備用.

1.4 MION -LP中含磷量的測(cè)定

將Sephadex G -50凝膠(作為柱填料)用超純水充分溶脹后填充到2.5 mL注射器(去塞加濾板)中，然后用超純水平衡30 min.吸取1 mL MION -LP 的水溶液置于已處理的凝膠柱中，用超純水洗脫后將洗脫液收集至試管(刻度為0.5 mL)中并加入消化劑(消化劑的配置方法為：將140 mL的濃硫酸加入到盛有250 mL蒸餾水的500 mL容量瓶中，混合，冷卻后加入70%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高氯酸32.5 mL，再用蒸餾水定容)；加熱，消化至溶液澄清后將其放置至冷卻；加入顯色劑(其中a液為含2.5 g鉬酸銨、8.2 g無(wú)水醋酸鈉的1 000 mL混合溶液，b液為10%抗壞血酸溶液， a、b液為體積比為9∶1的混合液(現(xiàn)配現(xiàn)用))，在70 ℃水浴中加熱10 min.測(cè)定含磷溶液的吸收度(700 nm處)，計(jì)算含磷量并繪制磷含量-洗脫液體積數(shù)的曲線.在分離后的MION -LP溶液中加入2%的乳糖(凍干保護(hù)劑)，混勻后將其放入冰箱(-80 ℃)內(nèi)冷凍12 h，然后將其放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥72 h即得MION-LP凍干粉.

1.5 MION -LP的包封率測(cè)定

分別吸取同體積分離后的MION -LP溶液和MION溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸羥胺溶液，搖勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的鄰二氮菲和1 mol·L-1乙酸溶液，并用蒸餾水定容.在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定橘紅色配合物的吸光度[7]，由此得到MION -LP 溶液中鐵離子的質(zhì)量濃度，然后用 MION -LP 溶液中的鐵離子的質(zhì)量濃度與MION溶液中鐵離子的質(zhì)量濃度的比值即可計(jì)算得到MION -LP溶液中MION的包封率[8].

1.6 MION -LP的體外評(píng)價(jià)

1)MION -LP的細(xì)胞毒性測(cè)定.將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以2×104個(gè)/孔(HepG2細(xì)胞)和1×104個(gè)/孔(SPC -A1細(xì)胞和SMMC -7721細(xì)胞)的細(xì)胞密度接種在96孔板中.在37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～22 h后，分別加入不同鐵離子濃度的MION和MION -LP溶液.在空白對(duì)照組中加入無(wú)血清的培養(yǎng)基，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h.將MTT溶液加入到板孔中，然后將孔板用鋁箔紙包裹后放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；吸去上清液后加入二甲基亞砜溶液；使用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定溶液吸光度(OD)，并利用OD實(shí)驗(yàn)與OD空白的比值計(jì)算細(xì)胞的存活率.

2) 細(xì)胞攝取MION-LP的測(cè)定.采用普魯士藍(lán)試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝取的MION -LP進(jìn)行染色，結(jié)果顯示MION為藍(lán)色.將細(xì)胞以6×105個(gè)/孔(HepG2細(xì)胞)和4×105個(gè)/孔(SMMC -7721細(xì)胞)的細(xì)胞密度接種于6孔板中，在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)18～22 h后分別加入鐵離子質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1的MION -LP.在空白對(duì)照組中加入無(wú)血清的培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)6 h后去除板孔中的游離藥物及死細(xì)胞.每孔加入4%多聚甲醛(用于固定細(xì)胞)，靜置30 min后除去多聚甲醛，再加入普魯士藍(lán)染色試劑盒中A1液和A2液的等體積混合液，染色30 min.使用PBS清洗細(xì)胞3次，然后在每孔中加入普魯士藍(lán)染色試劑盒中的B液，染色10 min.使用PBS清洗細(xì)胞3次，然后將6孔板置于熒光電子顯微鏡下觀察并拍攝.

人工導(dǎo)播：課程錄制可以根據(jù)需要進(jìn)行人工導(dǎo)播的錄制。系統(tǒng)可根據(jù)多種導(dǎo)播策略，對(duì)教師、學(xué)生、板書(shū)和教學(xué)視頻資源進(jìn)行無(wú)縫切換，使錄制后的課件內(nèi)容更加豐富，避免單一的場(chǎng)景。人工導(dǎo)播需要有協(xié)助講課教師的人員來(lái)進(jìn)行導(dǎo)播。

3) 體外MRI成像能力的檢測(cè).配制鐵離子質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8 μg·mL-1的MION溶液和 MION -LP 溶液.將溶液置于離心管內(nèi)，加入300 μL的熱瓊脂糖溶液，然后利用渦旋振蕩器充分混勻溶液后冷卻；取上清液進(jìn)行MRI體外檢測(cè)(自旋時(shí)間3 700 ms，回波時(shí)間117 ms，成像野12 cm×12 cm，層厚2 mm).

1.7 MION -LP的體內(nèi)評(píng)價(jià)

將SPC -A1細(xì)胞接種于6只BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下.接種后的裸鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，并定期觀察裸鼠的生存條件、生長(zhǎng)狀況和測(cè)量裸鼠腫瘤大小(使用游標(biāo)卡尺).腫瘤增長(zhǎng)至約200 mm3(腫瘤體積=1/2×腫瘤的長(zhǎng)×腫瘤的寬×腫瘤的高)時(shí)即表明荷瘤裸鼠模型建立成功.腫瘤增長(zhǎng)至600 mm3時(shí)，將荷瘤裸鼠平均分為兩組(空白對(duì)照組和 MION -LP 實(shí)驗(yàn)組).于荷瘤裸鼠腹腔注射1 mg·kg-1的20%烏拉坦.麻醉荷瘤裸鼠后，擺置俯臥位，并使用醫(yī)用膠帶將其四肢和尾部固定在紙板上.荷瘤裸鼠呼吸勻速后，將紙板置于膝關(guān)節(jié)線圈內(nèi)，并依次掃描裸鼠的腫瘤橫向位置.掃描結(jié)束后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠的尾靜脈注射MION -LP(劑量為30 mg·kg-1)，然后分別間隔0.5、1、 1.5、 2、 2.5、 3 h再次將裸鼠置于膝關(guān)節(jié)線圈內(nèi)，并依次掃描(行常規(guī)T2WI掃描)裸鼠的腫瘤橫向位置.將掃描數(shù)據(jù)收集到西門(mén)子工作站對(duì)腫瘤區(qū)域給藥前后的組織信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量.測(cè)量時(shí)以0.02 sq.cm大小為感興趣區(qū)域(ROI)，取3次測(cè)量的平均值，并采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析.T2WI掃描的具體參數(shù)為：TSE序列，TE 117 ms, TR3100，反轉(zhuǎn)角89°，層厚2 mm，矩陣256×1 256，體素0.3 mm×0.3 mm×0.9 mm.

1.8 荷瘤裸鼠的組織病理染色

1) HE染色荷瘤裸鼠組織.對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行MRI掃描后，剝離其腫瘤、肝臟和脾臟組織，并將各組織放入福爾馬林溶液中對(duì)其進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片.將切片放置到恒溫箱(60 ℃)過(guò)夜后再在室溫下放置20 min，然后用二甲苯溶液浸泡(10 min)，乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)分別為100%、95%、85%)梯度浸泡(每次浸泡3 min并用自來(lái)水沖洗10 min)，蘇木素染色(自來(lái)水沖洗10 min)，伊紅染色(2 min)，乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)分別為5%、95%、100%)梯度脫水，二甲苯溶液浸泡(3 min)，中性樹(shù)膠封片.在熒光顯微鏡下觀察封片并拍攝圖片.

2) 普魯士藍(lán)染色荷瘤裸鼠組織.荷瘤裸鼠組織經(jīng)切片和脫蠟后，滴加普魯士藍(lán)試劑盒中A1和A2的混合液，避光50 min后用流水沖洗去余色5 min；滴加普魯士藍(lán)B液染色30 s，流水沖洗5 s去余色，然后依次將切片放入乙醇和二甲苯中脫水，中性樹(shù)膠封片.在熒光顯微鏡下觀察封片并拍攝圖片.

2 結(jié)果與分析

采用共沉淀法合成MION，除去其中的小分子(采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為6 000～8 000的透析袋透析)后得到純化的MION.圖1為MION的X射線衍射圖.由圖1可以看出，MION的衍射峰出現(xiàn)在30.3(220)、35.6(311)、43(400)、53.8(422)、57.4(511)、62.7(440)處，這些峰與Fe3O4(反式尖晶石結(jié)構(gòu))的標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS 01-085-1436)[6]中的特征衍射峰一致.

由MION的粒徑圖(圖2(A))和Zeta電位圖(圖2(B))可知，MION的粒徑為(43.79±1.08) nm， Zeta電位為(20.36±2.93) mV.由MION -LP 粒徑圖(圖2(C))和Zeta電位圖(圖2(D))可知，MION -LP的粒徑為(68.82±0.16) nm， Zeta電位為(-7.81±0.82) mV.MION -LP的粒徑大于MION的粒徑表明，LP的加入增加了MION的粒徑.另外，MION -LP呈負(fù)電表明LP對(duì)MION進(jìn)行了包覆.由MION和MION -LP的透射電子顯微鏡圖(圖2(E)和圖2(F))可知，MION -LP呈球形，內(nèi)部隱約可見(jiàn)MION的顆粒，這再次證明LP對(duì)MION進(jìn)行了包覆.

采用葡聚糖凝膠柱層析法分離未被包覆的MION，得到含有MION -LP的洗脫液.根據(jù)比色法測(cè)定洗脫液中無(wú)機(jī)磷的質(zhì)量.圖3為MION-LP的磷脂洗脫曲線.由圖3可以看出，第3次洗脫之后得到的洗脫液中磷含量低于0.5 μg，表明包封的脂質(zhì)體在第3次洗脫后其大部分已經(jīng)流出.因此，本文取前3次得到的MION -LP洗脫液作為活性測(cè)試樣品.

以測(cè)定MION和MION -LP的鐵離子的質(zhì)量濃度(x)與吸光度(y)做線性回歸，結(jié)果表明在0～2.5 μg·mL-1范圍內(nèi)，鐵離子的質(zhì)量濃度與吸光度呈線性關(guān)系，其回歸方程為:y=0.194 5x-0.004 6,R2=0.999 8.在510 nm處測(cè)定MION -LP和MION溶液的吸光度，由此得到MION -LP和MION的鐵離子的質(zhì)量濃度分別為(64.57±0.15) μg·mL-1和71.24 μg·mL-1，經(jīng)進(jìn)一步計(jì)算得MION 的包封率為(90.64±0.21)%.

采用MTT法測(cè)定了MION和MION -LP在HepG2、SPC -A1和SMMC -7721 3種細(xì)胞中的毒性，結(jié)果如圖4所示.由圖4(A)可知，加入含有不同質(zhì)量濃度鐵離子的MION的無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，3種細(xì)胞的存活率均在80%以上，這表明MION溶液對(duì)3種細(xì)胞的存活率未造成較大影響.由圖4(B)可知，加入含有不同質(zhì)量濃度鐵離子的MION -LP的無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)鐵濃度大于8 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率低于80%，這表明MION -LP具有一定的細(xì)胞毒性.為避免MION -LP對(duì)細(xì)胞的毒性作用，選擇鐵離子的質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1的MION -LP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)，并用普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞攝取MION -LP的情況進(jìn)行了觀察.圖5為MION -LP與HepG2、SMMC -7721孵育6 h后的染色圖.由圖5可以看出，兩種細(xì)胞內(nèi)均有較多的藍(lán)染顆粒，這表明細(xì)胞攝取了較多的MION -LP，即MION -LP可增強(qiáng)MRI的成像效果.

由圖6可知，隨著MION和MION -LP中鐵離子質(zhì)量濃度的增加，MRI的信號(hào)逐漸降低.為了驗(yàn)證MION -LP在體內(nèi)的成像效果，對(duì)荷瘤裸鼠的尾靜脈注射了MION -LP，并對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤部位進(jìn)行了T2WI序列平掃，結(jié)果如圖7(A)所示.由圖7(A)可以看出，隨著對(duì)裸鼠腫瘤部位掃描時(shí)間的增加，其圖像逐漸成灰色.為對(duì)比腫瘤區(qū)域給藥前后的組織信號(hào)強(qiáng)度，以0.02 sq.cm大小為ROI，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果如圖7(B)所示.由圖7(B)可以看出，給藥后3 h內(nèi)的ROI信號(hào)強(qiáng)度與給藥前的ROI信號(hào)強(qiáng)度相比，給藥后的ROI信號(hào)強(qiáng)度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈顯著性差異(*P<0.05).由此表明，對(duì)荷瘤裸鼠的尾靜脈注射MION -LP后，MION -LP在腫瘤部位出現(xiàn)聚集，進(jìn)而說(shuō)明MION -LP對(duì)腫瘤部位具有一定的靶向性.

圖8為腫瘤組織的染色圖，其中圖8(A)為空白對(duì)照組的HE染色，圖8(B)為MION -LP實(shí)驗(yàn)組的HE染色，圖8(C)為MION -LP實(shí)驗(yàn)組的普魯士藍(lán)染色.由空白對(duì)照組圖8(A)和MION -LP實(shí)驗(yàn)組圖8(B)中的HE染色可以看到，細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞核變大且形狀不規(guī)則，核質(zhì)比例失調(diào)，這表明成功建立了荷瘤裸鼠模型.由圖8(C)可以看出，在經(jīng)過(guò)普魯士藍(lán)染色的腫瘤切片內(nèi)未觀察到藍(lán)染顆粒，說(shuō)明MION經(jīng)脂質(zhì)體運(yùn)輸至腫瘤部位后，其又經(jīng)過(guò)血液循環(huán)被送至其他組織中，即表明MION不會(huì)在腫瘤部位累積.

肝臟組織的HE染色和普魯士藍(lán)染色如圖9所示.由圖9(A)可以看出，肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，且切片內(nèi)有肝臟特有的肝血竇結(jié)構(gòu)，由此可確定切片為肝臟組織.肝臟組織的普魯士藍(lán)染色如圖9(B)所示.由圖9(B)可以看出，肝臟切片內(nèi)有明顯的藍(lán)染顆粒，說(shuō)明荷瘤裸鼠尾靜脈注射的MION -LP已到達(dá)肝臟內(nèi).脾臟組織的HE染色如圖9(C)所示.由圖9(C)可以看出，脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，且切片內(nèi)紫紅色的部分為紅髓，分散于紅髓間的藍(lán)色小點(diǎn)為白髓結(jié)構(gòu)，由此可確定切片為脾臟組織.研究[10-12]表明，MION -LP被遞送到腫瘤部位后，其經(jīng)過(guò)血液循環(huán)到達(dá)肝臟和脾臟內(nèi)后能夠被肝脾庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffer cell)吸收、清除.脾臟組織的普魯士藍(lán)染色如圖9(D)所示.由圖9(D)可以看出，脾臟切片內(nèi)有明顯的藍(lán)染顆粒，說(shuō)明在荷瘤裸鼠尾靜脈注射的MION -LP已到達(dá)脾臟內(nèi)并被代謝.

3 結(jié)論

本文利用薄膜分散法成功制得了MION -LP，且方法簡(jiǎn)單.通過(guò)體外和體內(nèi)對(duì)MION -LP進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)表明，MION -LP可以在不影響組織正常狀態(tài)下獲得良好的MRI成像效果.本文研究結(jié)果可為MION的應(yīng)用提供理論參考.今后我們將在MION -LP中加入抗腫瘤藥物以對(duì)其治療腫瘤的效果進(jìn)行研究.