益津降糖顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)研究

滿(mǎn)小溪，許春燕*，高光男，楊德智，閔俊哲*

(1.延邊大學(xué) 藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2.延邊朝藥藥業(yè)有限公司， 吉林 龍井 133400 )

益津降糖顆粒由吉林延邊朝藥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，該顆粒由人參、白術(shù)(炒)、茯苓、仙人掌、甘草5味藥材制成，具有健脾益氣、生津止渴的功效，常用于治療II型糖尿病.益津降糖顆粒于2002年正式獲得新藥證書(shū)， 2005年其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由新藥試行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)為正式標(biāo)準(zhǔn).在該顆粒的原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，甘草、仙人掌在定性鑒別時(shí)存在斑點(diǎn)不清晰和無(wú)相應(yīng)對(duì)照品斑點(diǎn)的問(wèn)題，而且人參皂苷Re未采用2020年版《中國(guó)藥典》[1]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定(采用的是薄層斑點(diǎn)掃描法).為此，本文對(duì)益津降糖顆粒方劑中的甘草、仙人掌的定性鑒別進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)人參皂苷Re采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行含量測(cè)定改進(jìn)，以此完善益津降糖顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Primaide)和紫外檢測(cè)器，HITACHI公司；紫外燈分析儀(ZF-1)，上海金鵬分析儀器有限公司；多功能超純水系統(tǒng)(Unique-R20)，廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司；超聲波清洗器(KQ -250DE)，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平(AL-104)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；電子天平(DV215CD)，上海奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；漩渦混合器(XH-C)，金壇市白塔新寶儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(OHG -907385-Ⅲ)，上海新苗醫(yī)療器械有限公司.

1.2 試劑

人參皂苷Re(批號(hào)為110754-201827)、人參皂苷Rg1(批號(hào)為110703-201933)、人參(批號(hào)為120917-201712)、甘草(批號(hào)為120904-201620)、仙人掌(批號(hào)為121283-201303)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；益津降糖顆粒(批號(hào)分別為T(mén)20180801、T20180802、T20180901、T20180902)， 由延邊朝藥藥業(yè)有限公司提供；不含甘草的益津降糖顆粒陰性對(duì)照藥品、不含仙人掌的益津降糖顆粒陰性對(duì)照藥品、不含人參的益津降糖顆粒陰性對(duì)照藥品，均由延邊朝藥藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室配制；硅膠G薄層板，青島海洋化工廠分廠；聚酰胺薄膜板，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，天津賽孚瑞科技有限公司；無(wú)水乙醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水，延邊大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備；三氯甲烷(分析純)，北京化工廠；正丁醇(分析純)、丙酮(分析純)、甲苯，沈陽(yáng)市華東試劑廠；工業(yè)乙酸乙酯，延吉浩然化工有限公司；甲酸、氫氧化鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司.

2 檢驗(yàn)方法

2.1 定性鑒別

2.1.1人參的定性鑒別

取10.058 6 g研細(xì)的裝量差異項(xiàng)下的益津降糖顆粒內(nèi)容物置于索氏提取器中，加入適量的甲醇后加熱回流6 h；蒸干提取液，殘?jiān)铀?0 mL，用水飽和正丁醇振搖提取5×20 mL；合并正丁醇提取液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉溶液洗滌4×40 mL；去除氫氧化鈉洗液后用50 mL正丁醇飽和水洗滌1次，去除水層后取正丁醇液；旋干正丁醇液，殘?jiān)蛹状己髮⑵滢D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，稀釋至刻度后作為供試品溶液.

取人參對(duì)照藥材0.603 2 g，按照供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液.另取對(duì)照品人參皂苷Rg1和Re，加甲醇制成1 mg/mL的混合溶液(作為對(duì)照品溶液).取不含人參的陰性對(duì)照品10.007 4 g，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液.按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0502中的TLC方法對(duì)人參進(jìn)行定性鑒別.吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，然后以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比為15∶40∶22∶10)的下層溶液為展開(kāi)劑(溫度低于10 ℃)展開(kāi)，晾干后噴硫酸-乙醇溶液(體積比為1∶9)顯色，并在105 ℃下加熱約3 min.供試品與對(duì)照藥材、對(duì)照品的TLC結(jié)果如圖1所示.

2.1.2甘草的定性鑒別

取10.027 6 g研細(xì)的裝量差異項(xiàng)下的益津降糖顆粒內(nèi)容物置于索氏提取器中，加入適量的乙醚后加熱回流1 h；過(guò)濾，棄去乙醚液，藥渣再加入適量的甲醇后加熱回流3 h；過(guò)濾，蒸干提取液，殘?jiān)?0 mL水使其溶解；用水飽和的正丁醇振搖提取3×20 mL，然后合并正丁醇提取液；水洗3次，棄去水層，蒸干正丁醇液，殘?jiān)蛹状际蛊淙芙?；將溶液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容、搖勻后將其作為供試品溶液.

取甘草對(duì)照藥材1.007 2 g，按照供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液.取不含甘草的陰性對(duì)照品10.026 6 g，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液.按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0502中的TLC方法對(duì)甘草進(jìn)行定性鑒別.吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-甲醇(體積比為5∶5∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi)，晾干后噴硫酸-乙醇溶液(體積比為1∶9)顯色，并在105 ℃下加熱3 min.供試品與對(duì)照藥材的TLC結(jié)果如圖1所示.

2.1.3仙人掌的定性鑒別

取2.009 6 g研細(xì)的裝量差異項(xiàng)下的益津降糖顆粒內(nèi)容物置于索氏提取器中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇并浸泡12 h；過(guò)濾，旋干濾液，然后加10 mL水使其溶解；用乙酸乙酯提取3×20 mL，然后合并乙酸乙酯提取液；過(guò)濾，旋干濾液，加入1 mL甲醇即得供試品溶液.

取仙人掌對(duì)照藥材4.006 1 g置于索氏提取器中，加入適量的水后加熱回流4 h；過(guò)濾，用乙酸乙酯提取3×20 mL，然后合并乙酸乙酯提取液；過(guò)濾，旋干濾液，加入1 mL甲醇即得對(duì)照藥材溶液.

取不含仙人掌的陰性對(duì)照品2.006 7 g，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液.按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0502中的TLC方法對(duì)仙人掌進(jìn)行定性鑒別.吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，然后以丙酮-甲醇-水-甲酸(體積比為3∶3∶5∶1.5)為展開(kāi)劑展開(kāi)，晾干后噴三氯化鋁-乙醇溶液(1 g三氯化鋁溶于100 mL乙醇溶液)顯色，并在105 ℃下加熱3 min.供試品與對(duì)照藥材的TLC結(jié)果如圖1所示.

2.2 人參皂苷Re的含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液的制備

1)對(duì)照品溶液的制備.精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品和人參皂苷Re對(duì)照品，然后加入甲醇制成0.2 mg/mL的混合溶液，搖勻后即得對(duì)照品溶液.

2)供試品溶液的制備.取2.002 3 g研細(xì)的裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物置于索氏提取器中，加入適量的三氯甲烷后加熱回流3 h；揮干溶劑后的藥渣用50 mL正丁醇溶解，然后移入100 mL錐形瓶中；超聲30 min，過(guò)濾，量取續(xù)濾液25 mL，蒸干；殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中定容，搖勻，過(guò)濾，所得濾液即為供試品溶液.

3)陰性對(duì)照溶液的制備.稱(chēng)取不含人參的陰性對(duì)照顆粒2.008 0 g，與供試品同法制備即得陰性對(duì)照溶液.

2.2.2HPLC譜圖的獲取

色譜柱為Sepax Bio -C18 (4.6 mm×250 mm, 5.0 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL.參考2020年版《中國(guó)藥典》(一部)人參項(xiàng)下的條目及文獻(xiàn)[2-9]對(duì)A、B兩種流動(dòng)相考察.A相為乙腈-水溶液，洗脫梯度為：0～35 min，19%乙腈；35～55 min，19%～29%乙腈； 55～70 min，29%乙腈；70～100 min，29%～40%乙腈.B相為乙腈-0.05%磷酸溶液(體積比為20∶80).人參皂苷Rg1、Re的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的HPLC圖如圖2所示.

2.2.3方法學(xué)考察

1)線(xiàn)性關(guān)系考察.分別取5 μL不同濃度的人參皂苷Re(0.01、0.05、0.1、0.2、1.0、2.0 mg/mL)，然后按2.2.2色譜條件測(cè)定其峰面積.以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)、人參皂苷Re的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性結(jié)果如表1所示.

2)精密度試驗(yàn).精密吸取5 μL進(jìn)樣(2.2.1中制備的人參皂苷Re對(duì)照品溶液)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.由表2可知，人參皂苷Re對(duì)照品溶液的RSD值為2.48%，這表明色譜系統(tǒng)的響應(yīng)值具有良好的重復(fù)性.

表1 人參皂苷Re的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程及檢測(cè)限

表2 人參皂苷Re精密度的試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

3)穩(wěn)定性試驗(yàn).精密吸取5 μL進(jìn)樣(2.2.1中制備的人參皂苷Re對(duì)照品溶液)，并間隔2 h進(jìn)樣，結(jié)果如表3所示.由表3可知，在72 h內(nèi)人參皂苷Re的峰面積的平均值為229 737， RSD值為1.22%，這表明人參皂苷Re在72 h內(nèi)穩(wěn)定.

4)專(zhuān)屬性試驗(yàn).分別吸取5 μL 2.2.1中制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按2.2.2中的色譜條件測(cè)定其HPLC， 結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出：供試品色譜中有與對(duì)照品一致的色譜峰，并且該峰與其他峰相分離；陰性對(duì)照溶液(空白試驗(yàn))中未出現(xiàn)干擾峰，即不干擾主成分的測(cè)定.由此表明，上述實(shí)驗(yàn)的分析方法具有專(zhuān)屬性.

5)加標(biāo)回收試驗(yàn).精密稱(chēng)取5 mg人參皂苷Re對(duì)照品，再稱(chēng)取研細(xì)的裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約2 g，然后將二者置于同一索氏提取器中；加入50 mL的三氯甲烷后加熱回流3 h，然后將揮干溶劑的藥渣連同濾紙移入100 mL錐形瓶中，加50 mL正丁醇，浸泡過(guò)夜；超聲30 min(功率為250 W，頻率為50 kHz)，過(guò)濾；棄去初濾液，量取續(xù)濾液25 mL，旋干；殘?jiān)尤爰状际蛊淙芙夂髮⑵滢D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容至刻度；搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液按2.2.2中的方法進(jìn)樣，結(jié)果如表4所示.由表4可以看出，供試品溶液中的人參皂苷Re的回收率為85.40%～116.09%，平均回收率為92.88%， RSD值為12.43%.

表3 人參皂苷Re對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

表4 益津降糖顆粒供試品的回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4實(shí)際樣品含量測(cè)定

按照2.2.2中的方法對(duì)4個(gè)批次的供試品(T20180801、T20180802、T20180901、T20180902)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示.由表5可以看出，人參皂苷Re的RSD值為2.88%，且每個(gè)批次樣品中的人參皂苷Re的含量均大于1.2 mg(每袋益津降糖顆粒為5 g，且規(guī)定每袋中人參皂苷Re的含量不低于3 mg，因此2 g益津降糖顆粒應(yīng)含人參皂苷Re不低于1.2 mg)，由此表明益津降糖顆粒制劑中的人參皂苷Re的含量符合益津降糖顆粒的質(zhì)量要求.

表5 供試品中人參皂苷Re含量的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果與分析

3.1 定性鑒別

本文選用2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法對(duì)甘草進(jìn)行前處理.由該方法得到的甘草斑點(diǎn)純凈，通過(guò)斑點(diǎn)的深淺即可判定甘草的量.對(duì)3種展開(kāi)劑(乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(體積比為15∶1∶1∶2)、甲苯-三氯甲烷-甲醇(體積比為5∶5∶1)和丙酮-水-甲酸(體積比為1∶1∶0.1))進(jìn)行比較可知，當(dāng)使用甲苯-三氯甲烷-甲醇為展開(kāi)劑(體積比為5∶5∶1)時(shí)，供試品色譜在對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯示出8個(gè)顏色相同的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)的分離度和顯色均優(yōu)于其他兩種展開(kāi)劑，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)明顯干擾(見(jiàn)圖1)；因此，本文選擇甲苯-三氯甲烷-甲醇(體積比為5∶5∶1)為展開(kāi)劑.

采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液制備仙人掌對(duì)照藥材溶液進(jìn)行仙人掌定性鑒別時(shí)，供試品溶液、對(duì)照品溶液的斑點(diǎn)不在同一位置，不具有對(duì)應(yīng)性；而采用水溶液制備仙人掌對(duì)照藥材溶液進(jìn)行仙人掌定性鑒別時(shí)，供試品溶液與對(duì)照品溶液的斑點(diǎn)出現(xiàn)在同一位置，即具有良好的對(duì)應(yīng)性，這可能是70%乙醇的仙人掌提取物的溶解度優(yōu)于水提取物的緣故[11-12]，進(jìn)而使仙人掌對(duì)照藥材溶液中所含提取物的質(zhì)量濃度高于供試品中所含提取物的質(zhì)量濃度.在文獻(xiàn)[13-15]研究基礎(chǔ)上，本文利用不同展開(kāi)劑(三氯甲烷-甲醇-甲酸(體積比為2∶3∶1)和丙酮-甲醇-水-甲酸(體積比為3∶3∶4∶1.5)對(duì)仙人掌的展開(kāi)效果和不同比例甲酸對(duì)仙人掌展開(kāi)斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象的影響進(jìn)行了考察.考察結(jié)果顯示，使用展開(kāi)劑丙酮-甲醇-水-甲酸(體積分?jǐn)?shù)比為3∶3∶4∶1.5)時(shí)，供試品色譜在對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯示出6個(gè)相同顏色的規(guī)則斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)的分離度和顯色均優(yōu)于另一種展開(kāi)劑，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)明顯干擾(見(jiàn)圖1)；因此，本文選擇丙酮-甲醇-水-甲酸(體積分?jǐn)?shù)比為3∶3∶4∶1.5)為展開(kāi)劑.

3.2 定量測(cè)定

由圖2可知，2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的流動(dòng)相和乙腈-0.05%磷酸水(體積比為20∶80)流動(dòng)相均可以使人參皂苷Rg1、Re達(dá)到完全分離(分離度≥1.5).但是，使用2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的流動(dòng)相所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的色譜圖中Re的峰面積均顯著大于Rg1的峰面積，且分析時(shí)間較長(zhǎng)(人參皂苷Rg1、Re的出峰時(shí)間為45 min，梯度洗脫時(shí)間為115 min)；而使用乙腈-0.05%磷酸水(體積比為20∶80)流動(dòng)相，不僅可以明顯改善Rg1和Re的吸收強(qiáng)度，使二者的峰面積接近，而且可減少分析時(shí)間(人參皂苷Rg1、Re的出峰時(shí)間為35 min，梯度洗脫時(shí)間為45 min).

4 結(jié)論

本文利用TLC方法，以甲苯-三氯甲烷-甲醇(體積分?jǐn)?shù)比為5∶5∶1)和丙酮-甲醇-水-甲酸(體積分?jǐn)?shù)比為3∶3∶4∶1.5)為展開(kāi)劑，分別對(duì)益津降糖顆粒方劑中的甘草、仙人掌的定性鑒別進(jìn)行優(yōu)化表明，優(yōu)化后的甘草和仙人掌在定性鑒別時(shí)其分離度、重現(xiàn)性、專(zhuān)屬性均良好.利用HPLC方法(以Sepax Bio -C18 為色譜柱， 0.05%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相)對(duì)人參皂苷Re含量進(jìn)行測(cè)定表明，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD值均小于2.48%，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)明顯干擾.另外HPLC方法的測(cè)定時(shí)間比2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的方法縮短了70 min，且明顯改善了2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定方法中存在的人參皂苷Re和Rg1的色譜峰響應(yīng)值差異較大的問(wèn)題.綜上，本文研究結(jié)果可為藥企提高產(chǎn)品質(zhì)量和檢測(cè)速度提供參考.