高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究進(jìn)展

吳 瓊, 隋欣桐, 田瑞軍

(南方科技大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系,廣東 深圳 518055)

蛋白質(zhì)組學(xué)是指大規(guī)模地對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)相互作用等進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組研究不僅可以全景式地揭示生命活動(dòng)的分子本質(zhì),還能闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制[1]。近年來(lái),色譜和質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步驅(qū)動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的快速增長(zhǎng),逐步實(shí)現(xiàn)了“深度覆蓋”,科學(xué)家們先后完成包括人類在內(nèi)的多個(gè)物種的蛋白質(zhì)組圖譜解析[2,3]。2020年,Mann等[4]系統(tǒng)性地繪制了100個(gè)跨物種的蛋白質(zhì)組圖譜,獲得了200萬(wàn)條肽段和34萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)的鑒定信息,為整個(gè)進(jìn)化范圍內(nèi)生物的功能組織研究提供重要依據(jù)。隨著生物醫(yī)學(xué)研究日益增長(zhǎng)的大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)分析需求,如何實(shí)現(xiàn)“高通量”的蛋白質(zhì)組學(xué)分析已成為當(dāng)前亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程通常包括樣品前處理、色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。該文將從以上4個(gè)方面介紹近10年以來(lái)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)取得的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 樣品前處理

樣品前處理是整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程的關(guān)鍵步驟,傳統(tǒng)樣品前處理流程依賴于多步的手工操作,不僅耗時(shí)且不可避免地存在人為誤差,成為限制蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的瓶頸之一。集成化的樣品前處理技術(shù)有利于提升蛋白質(zhì)組學(xué)分析的整體性能和靈敏度,如大連化物所張麗華課題組[5]結(jié)合在線蛋白質(zhì)酶解,同位素二甲基化標(biāo)記和多維肽段分離發(fā)展了蛋白質(zhì)組定量集成化平臺(tái),具有靈敏度高、定量重現(xiàn)好等優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期開(kāi)發(fā)了一種基于離心力的集成化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理技術(shù)(simple and integrated spintip-based proteomics technology,SISPROT)[6],通過(guò)將強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料和C18膜填充在槍頭中以集成化方式完成樣品前處理和多肽分級(jí)的全過(guò)程,顯著提升了蛋白質(zhì)組學(xué)分析的整體性能和靈敏度,并得到進(jìn)一步推廣[7-11]。高通量蛋白質(zhì)組學(xué)則對(duì)樣品前處理提出了更高要求,發(fā)展分析通量高、快速而穩(wěn)定的樣品前處理方法成為這一領(lǐng)域亟需解決的首要問(wèn)題。2014年,Yu等[12]在超濾膜輔助的樣品前處理方法(filter-aided sample preparation,FASP)基礎(chǔ)上發(fā)展了96通道的FASP(96FASP),該方法借助于96孔濾膜板進(jìn)行離心操作,從10 μg臨床尿液中可鑒定700～900個(gè)蛋白質(zhì)。Mann課題組[13]則發(fā)展了in-StageTip(iST)技術(shù),在內(nèi)置C18膜的封閉Tip頭內(nèi)可完成樣品前處理,并開(kāi)發(fā)了PreOmics試劑盒(https://preomics. com/products)。通過(guò)進(jìn)一步定制96通道的iST設(shè)備(96-well iST)并借助于多通道移液器可完成96個(gè)樣品前處理操作。然而,以上的樣本前處理方法雖然提高了分析通量,但仍然依賴于手工移液和轉(zhuǎn)移操作。

近十幾年來(lái),自動(dòng)化移液工作站相繼問(wèn)世,如賽默飛的自動(dòng)化磁珠提取系統(tǒng)King FisherTMFlex、安捷倫高精度的Bravo和精確流速控制的AssayMAPBravo、貝爾曼庫(kù)爾特的Biomek?NXP自動(dòng)化工作站等,使樣品前處理逐漸實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。自動(dòng)化移液工作站借助于機(jī)械臂完成96甚至384通道的移液操作,解放手工操作,大大促進(jìn)了高通量的樣品前處理技術(shù)發(fā)展。Mann等[14]將iST技術(shù)與Bravo自動(dòng)化平臺(tái)聯(lián)用,2 h內(nèi)可完成96個(gè)血漿樣品的前處理。最近,他們還將這項(xiàng)前處理工作流程應(yīng)用于100個(gè)不同類別生物體的蛋白質(zhì)圖譜解析[4]。Krijgsveld等開(kāi)發(fā)了基于磁珠的樣品前處理技術(shù)(single-pot solid-phase-enhanced sample preparation,SP3)[15,16],進(jìn)一步將SP3技術(shù)與Bravo平臺(tái)相結(jié)合開(kāi)發(fā)了autoSP3技術(shù),3.5 h可完成96個(gè)樣品的前處理,并具有優(yōu)異的穩(wěn)定性[17]。Leutert等[18]發(fā)展了快速,自動(dòng)化的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程(rapid-robotic phosphoproteomics,R2-P2),在King FisherTMFlex自動(dòng)化工作站上整合了SP3技術(shù)和基于Fe-IMAC磁珠的磷酸化富集技術(shù),實(shí)現(xiàn)5 h的磷酸化蛋白質(zhì)組前處理。自動(dòng)化移液工作站保證高通量分析的同時(shí),還能極大縮短前處理時(shí)間,以及減少大隊(duì)列樣品處理造成的人為誤差。然而,以上的這些樣品前處理工作流程還未能實(shí)現(xiàn)“零人工”操作的全自動(dòng)化。隨著高通量樣品前處理的不斷智能化,開(kāi)發(fā)“零人工”操作的全自動(dòng)化樣品前處理方法成為必然的發(fā)展趨勢(shì)。

2 色譜分離

色譜分離是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19-21],但目前的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)存在液相分離速度難以匹配質(zhì)譜采集速度、穩(wěn)定性不夠好等問(wèn)題[22],限制了高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。因此,在保證較為理想的蛋白質(zhì)組覆蓋度前提下,縮短液相色譜分離時(shí)間并提高分離穩(wěn)定性以滿足高通量數(shù)據(jù)采集的需求顯得尤為重要。傳統(tǒng)的“鳥(niǎo)槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)研究一般選擇納升級(jí)液相來(lái)獲得更高的檢測(cè)靈敏度,與此同時(shí)卻犧牲了分析通量與液相色譜分離的穩(wěn)定性。近年來(lái),微升流速液相色譜(micro-flow LC)或高流速液相色譜(high-flow LC)因其色譜穩(wěn)定性好、周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用在高通量蛋白質(zhì)組學(xué)。通過(guò)配合使用先進(jìn)的高靈敏度質(zhì)譜儀,可以有效解決由于稀釋效應(yīng)導(dǎo)致的靈敏度下降問(wèn)題。本課題組在前期開(kāi)發(fā)的Photo-pTyr-scaffold[23]與基于96孔板的Photo-pTyr-scaffold正向蛋白陣列平臺(tái)[24]的基礎(chǔ)上,開(kāi)發(fā)了高通量、快速的酪氨酸磷酸化(pTyr)信號(hào)復(fù)合物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析工作流程[25]。利用150 mm×150 μm分離柱在分離流速800 nL/min和20 min有效色譜梯度條件下完成高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析;通過(guò)與Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀聯(lián)用,在不增加樣品上樣量和不影響鑒定覆蓋度前提下,能夠快速、可重復(fù)地分析動(dòng)態(tài)pTyr信號(hào)蛋白質(zhì)復(fù)合物[25]。Bruderer等[26]利用150 mm×300 μm分離柱(流速5 μL/min,梯度40 min)完成了1 508例血漿樣本的分析,并且超過(guò)2 000次的進(jìn)樣沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堵塞(背壓只增加14%),表明micro-flow LC具有良好的穩(wěn)定性。Bian等[27]利用商品化150 mm×1 mm的C18色譜分離柱,以50 μL/min微升級(jí)流速聯(lián)合Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。在2 000個(gè)蛋白質(zhì)組的分析中具有色譜保留時(shí)間(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.3%)和蛋白質(zhì)定量(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<7.5%)的優(yōu)異重現(xiàn)性,并在16 h內(nèi)完成9 000多種蛋白質(zhì)的深度覆蓋分析;當(dāng)分析超過(guò)7 500個(gè)樣品時(shí),micro-flow LC-MS/MS的性能并沒(méi)有明顯下降。在COVID-19新冠病毒的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,Messner等[28]將Agilent 1290 Infinity II與TripleTOF 6600聯(lián)用,利用5 min的有效色譜梯度分離(50 mm×2.1 mm分離柱,流速800 μL/min)可實(shí)現(xiàn)每天180個(gè)樣品的分離分析。以上研究結(jié)果表明,micro-flow LC和high-flow LC具有分析通量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),在高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

另外一方面,蛋白質(zhì)組檢測(cè)效率受限于傳統(tǒng)液相色譜系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和分離能力,難以突破真正意義上的高通量分析。為了克服這一不足,新的液相系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。2018年,丹麥Evosep公司推出的新型液相系統(tǒng)-Evosep One同時(shí)具備創(chuàng)新型高低壓管路系統(tǒng)設(shè)計(jì)以及樣品洗脫和梯度預(yù)存儲(chǔ)技術(shù),可實(shí)現(xiàn)同步的快速上樣和色譜梯度分離,大幅度減少液相色譜分析時(shí)間。此外,Evotip技術(shù)通過(guò)減少色譜柱堵塞和殘留,提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性[29]。Mann等[30]利用Evosep One與timsTOF Pro質(zhì)譜儀聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)每天200個(gè)樣本分析(5.6 min有效梯度),在16次重復(fù)中鑒定到1 231種蛋白質(zhì)(進(jìn)樣量為50 ng)。因此,Evosep One能夠極大地提高樣本分析通量且具有優(yōu)異的穩(wěn)定性,從而助力蛋白質(zhì)組學(xué)分析真正跨入高通量時(shí)代。此外,Evosep one搭載Q Exactive HF-X/HF[31]、Orbitrap Fusion Lumos[32,33]、Orbitrap Exploris 480[34]等質(zhì)譜在不同大隊(duì)列蛋白質(zhì)組樣品中也得到了逐步推廣。

3 質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜儀是蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)利器,質(zhì)譜儀硬件和技術(shù)上的革新一直引領(lǐng)著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展。為了應(yīng)對(duì)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)挑戰(zhàn),開(kāi)發(fā)掃描速度快,靈敏度高的質(zhì)譜儀是近年來(lái)質(zhì)譜硬件發(fā)展的趨勢(shì)。近年來(lái),質(zhì)譜儀硬件方面的重大突破在于離子淌度功能(ion mobility)的引入,為蛋白質(zhì)組學(xué)分析增加了全新的分離維度,從而獲得更加全面的鑒定信息[35,36]。布魯克公司開(kāi)發(fā)的timsTOF Pro質(zhì)譜采用了捕集型離子淌度(trapped ion mobility spectrometry,TIMS)和平行累積連續(xù)碎裂(parallel accumulation serial fragmentation,PASEF[30])采集技術(shù),將離子累積、母離子選擇和碎裂同步進(jìn)行,從而實(shí)現(xiàn)了近100%的離子利用率、接近120 Hz二級(jí)譜掃描速度和超過(guò)20倍靈敏度的提高[30]。Mann等[29]通過(guò)將timsTOF Pro與Evosep One聯(lián)用,在11.5 min有效梯度下(每天100個(gè)樣本),從重癥感染患者的血漿中(上樣量為100 ng)定量到500個(gè)蛋白質(zhì),表明timsTOF Pro擁有極高的采集速度與靈敏度。另外,離子淌度的引入可以實(shí)現(xiàn)保留時(shí)間、質(zhì)荷比、離子強(qiáng)度和離子淌度的四維數(shù)據(jù)采集,使得蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)入了4D新時(shí)代?；贠rbitrap平臺(tái)的質(zhì)譜儀一直是蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主流技術(shù)。自2011年推出Q Exactive系列,2013年推出Orbitrap Tribrid系列和2019年推出Orbitrap Exploris系列質(zhì)譜以來(lái),其掃描速度、靈敏度和分辨率在不斷提高。例如,Q Exactive的掃描速度和分辨率只有12 Hz和14萬(wàn)(@m/z200)[37]。而Exploris 480擁有40 Hz的掃描速度和48萬(wàn)的超高分辨率(@m/z200),并搭載了新一代離子遷移分離裝置FAIMS(high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometer)。此外,全新四極桿質(zhì)量分析器使儀器的抗污染能力大幅度提升,并提高了離子選取效率。Olsen等[34]對(duì)Exploris 480聯(lián)合FAIMS的性能進(jìn)行了全面的評(píng)價(jià),在每天200個(gè)樣品的分析通量下(5 min有效色譜梯度)能鑒定到1 261個(gè)蛋白質(zhì)。因此,Exploris 480在保證蛋白質(zhì)鑒定覆蓋度的同時(shí)具備卓越的穩(wěn)定性和耐用性。timsTOF Pro與Exploris 480等離子淌度質(zhì)譜所帶來(lái)的采集速度和靈敏度的大幅提升使得短色譜梯度分離下也能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的深度覆蓋分析,為高通量蛋白質(zhì)鑒定提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

在過(guò)去的10年間,質(zhì)譜采集技術(shù)的發(fā)展和革新也推動(dòng)著蛋白質(zhì)組學(xué)研究邁向高通量。傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴型(data-dependent acquisition,DDA)采集模式因隨機(jī)性、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差等固有缺陷,限制了其在高通量蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。作為當(dāng)前最熱門的質(zhì)譜技術(shù)之一,數(shù)據(jù)非依賴型(data-independent acquisition,DIA)的質(zhì)譜采集模式利用全掃描對(duì)每個(gè)窗口區(qū)域中的所有母離子進(jìn)行碎裂檢測(cè),以獲得所有碎片離子信息,具有通量高、重現(xiàn)性好、定量準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)[38-40]。上述這些數(shù)據(jù)采集特征對(duì)于高通量蛋白質(zhì)組的定量分析具有顯著優(yōu)勢(shì)。近年來(lái),利用DIA進(jìn)行高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)。Ruedi等[41]利用DIA蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)手段研究了232例異卵雙生和同卵雙生個(gè)體的血漿樣本,闡述了血漿蛋白質(zhì)組在遺傳和非遺傳狀態(tài)下的變化情況。Mann等[42]對(duì)來(lái)自3個(gè)隊(duì)列的197例人群(非阿爾茲海默病組與阿爾茲海默病組)的腦脊液樣本進(jìn)行DIA數(shù)據(jù)采集,發(fā)現(xiàn)40種蛋白質(zhì)特征分子可以有效預(yù)測(cè)阿爾茲海默癥。隨著4D蛋白質(zhì)組學(xué)(4D-Proteomics)的興起,timsTOF Pro上最新的DIA技術(shù)(DIA-PASEF)賦予其4D數(shù)據(jù)的采集和匹配能力,增加的離子淌度信息相比傳統(tǒng)DIA技術(shù)更有效降低了數(shù)據(jù)匹配的假陽(yáng)性和缺失值,定量準(zhǔn)確度更高,更適合高通量的樣本采集。

4 數(shù)據(jù)處理

隨著樣本制備、色譜分離和質(zhì)譜技術(shù)的共同進(jìn)步,所要面臨的是如何對(duì)已獲得的海量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行高效的數(shù)據(jù)分析。在計(jì)算機(jī)技術(shù)迅猛發(fā)展的今天,基于人工智能、深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、機(jī)器學(xué)習(xí)等大數(shù)據(jù)分析方法提高了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析效率。

以DIA采集為例,共碎裂母離子的干擾導(dǎo)致譜圖極其復(fù)雜,在短色譜梯度分離的復(fù)雜樣品中干擾進(jìn)一步放大。Ralser課題組[43]開(kāi)發(fā)了利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析(用于分辨真實(shí)信號(hào)與噪聲)以及新的量化和信號(hào)校正策略來(lái)處理DIA數(shù)據(jù)的軟件(DIA-NN),提高了傳統(tǒng)DIA蛋白質(zhì)組學(xué)的定性定量分析能力,在3 h內(nèi)可完成364個(gè)酵母樣本的高通量數(shù)據(jù)處理。經(jīng)典的DIA定量分析流程是預(yù)先進(jìn)行DDA譜圖庫(kù)的構(gòu)建,再利用DDA譜圖庫(kù)從DIA數(shù)據(jù)中提取目標(biāo)肽段的信號(hào)進(jìn)行定量分析。為了進(jìn)一步推動(dòng)DIA技術(shù)的實(shí)用化,復(fù)旦大學(xué)喬亮課題組[44]利用深度學(xué)習(xí)算法開(kāi)發(fā)了從肽段或蛋白質(zhì)序列構(gòu)建譜圖庫(kù)的工具DeepDIA,實(shí)現(xiàn)了不依賴于DDA的DIA數(shù)據(jù)直接分析。Spectronaut是DIA數(shù)據(jù)檢索的主流軟件[45],隨著Spectronaut 14的發(fā)布,其包括的directDIA 2.0新算法可直接利用DIA數(shù)據(jù)構(gòu)建虛擬譜圖庫(kù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。其算法的定性和定量靈敏度接近DDA分級(jí)建庫(kù)的結(jié)果,可以省去耗時(shí)的DDA建庫(kù)過(guò)程。此外,Spectronaut 14還可以實(shí)現(xiàn)結(jié)果文件的自由組合,從而支持上萬(wàn)個(gè)DIA樣品的檢索和合并分析,極大地縮短了高通量的DIA數(shù)據(jù)解析時(shí)間。另外,蛋白質(zhì)組學(xué)搜索引擎的更新,加快了數(shù)據(jù)分析的進(jìn)程。軍事科學(xué)院徐平課題組[46]利用pFind的開(kāi)放式搜索對(duì)3種不同酶切的大規(guī)模數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索分析,從人睪丸組織中鑒定到了124個(gè)潛在的缺失蛋白質(zhì)。另一方面,Cox團(tuán)隊(duì)在今年更新的MaxQuant版本中開(kāi)發(fā)了專為4D-Proteomics使用的4D-MBR算法,即增用CCS值(collision cross section,碰撞截面積)這一新維度進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)齊,可顯著減少缺失值并提高匹配的可信性[47]。他們利用208個(gè)血漿樣本進(jìn)行分析,結(jié)果顯示4D-Proteomics技術(shù)可大大提高樣本LFQ(label free quantification)的數(shù)據(jù)完整性,且蛋白質(zhì)定量數(shù)目能提高90%。

5 結(jié)語(yǔ)

高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展至今,從樣品自動(dòng)化的高效制備、快速的蛋白質(zhì)組全景數(shù)據(jù)采集、到前沿的數(shù)據(jù)分析都取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)步?！叭詣?dòng)化樣品前處理”“微升流速液相色譜分離”“高靈敏離子淌度質(zhì)譜分析”或?qū)⒊蔀楦咄康鞍踪|(zhì)組學(xué)未來(lái)幾年的研究熱點(diǎn)。面對(duì)復(fù)雜的大隊(duì)列臨床樣本,高通量蛋白質(zhì)組學(xué)仍面臨如下挑戰(zhàn):(1)如何實(shí)現(xiàn)高通量、全自動(dòng)化的樣本前處理和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的無(wú)縫對(duì)接,從而完成樣品制備到數(shù)據(jù)采集的全流程自動(dòng)化操作;(2)由于臨床樣本的寬動(dòng)態(tài)范圍和高異質(zhì)性,短梯度下蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析仍需要提高,以期發(fā)現(xiàn)更多低豐度的功能生物標(biāo)志物;(3)蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確度需要進(jìn)一步改善以顯著區(qū)分噪聲與低豐度蛋白質(zhì)。此外,利用離子淌度氣相色譜分離代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液相色譜分離以實(shí)現(xiàn)超快速的復(fù)雜樣品分離可能成為該領(lǐng)域未來(lái)潛在的發(fā)展方向?？偠灾?預(yù)期在不久的將來(lái)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將會(huì)逐步“落地轉(zhuǎn)化”,成為大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)分析的利器。