基于雌激素受體介導(dǎo)的神經(jīng)營養(yǎng)因子通路探討左歸丸對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

劉 宏 易婭靜 于 穎 代巧妹 張雨薇 楊 婧 張 博 仲麗麗

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040；5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040

卒中后神經(jīng)損傷是致殘的主要原因[1]。腦卒中是一種具有兩性差異的疾病，女性患腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)比男性低。然而，這種保護(hù)作用在絕經(jīng)后由于內(nèi)源性雌激素的丟失而減弱。雌激素替代療法在實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)中存在爭議[2-4]。古方左歸丸出自《景岳全書》，具有填精髓、補(bǔ)腎陰之效[5]。在臨床被用于治療肝腎陰虛型腦梗死恢復(fù)期、腦供血不足型眩暈、腦卒中后遺癥患者呈反復(fù)頭暈、頭痛伴手足麻木、腰酸耳鳴、記憶力減退等屬腎精虧損、髓海空虛諸癥[6-7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腎主生殖”[8]，腎的部分功能相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“下丘腦-垂體-性腺軸”[9]的功能。有實(shí)驗(yàn)顯示[10]左歸丸可明顯提高去卵巢大鼠海馬ERβ 表達(dá)，改善其驚恐反應(yīng)，并可通過上調(diào)海馬組織及齒狀回神經(jīng)生長因子（NGF）水平來延緩大鼠衰老[11]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，左歸丸還可以通過上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平改善受驚嚇大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）大鼠的缺血再灌注損傷[12]。然而，左歸丸預(yù)處理是否通過雌激素受體介導(dǎo)的BDNF 和NGF 信號(hào)通路改善腦缺血再灌注損傷仍不清楚。本研究探討左歸丸是否通過調(diào)節(jié)雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雌性SD 大鼠，SPF 級，8～10 周齡，170～230 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠置于籠內(nèi)[溫度（22±1）℃，濕度45%～55%]，12 h 燈/12 h 暗循環(huán)，允許隨意獲取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)方案均符合黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用規(guī)范》。

1.2 主要藥物和試劑

左歸丸（北京同仁堂藥店，批號(hào)：070503）；17β-雌二醇（Beyotime，貨號(hào)：MB1098）；ICI182780（medchemexpress，貨號(hào)：HY-13636）；anti-ERα（Proteintech Group，貨號(hào)：21244-1-AP）；anti-ERβ（Sangon Biotech，貨號(hào)：14007-1-AP）；anti-BDNF（Sangon Biotech，貨號(hào)：D121057）；anti-NGF（Boster，貨號(hào)：BA0611-2）；antip-CREB（Bioss，貨號(hào)：bs-0036R）；anti-TrkB（Bioss，貨號(hào)：bs-0175R）；anti-TrkA（Bioss，貨號(hào)：bs-0193R）；βactin（Bioss，貨號(hào)：bsm-33139M）。

1.3 分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為六組（n=18）：假手術(shù)組（只切口不插栓線）、I/R 組（Longa 線栓法行MCAO 手術(shù)）、OVX+I/R 組（卵巢摘除+MCAO 手術(shù)）、OVX+I/R+Zuogui Pills 組（卵巢摘除+MCAO 手術(shù)+左歸丸1.62 g/kg，灌胃）、OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780組（卵巢摘除+MCAO 手術(shù)+左歸丸灌胃+ICI182780 3 mg/kg，腹腔注射）、OVX+I/R+17β-estradiol 組（卵巢摘除+MCAO 手術(shù)+17β-estradiol 100 μg/kg，腹腔注射）。用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，在大鼠腹部正中開小切口，行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)（ovariectomy，OVX），術(shù)后，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠只切口不摘除雙側(cè)卵巢。OVX 后3 d，OVX 雌性大鼠給予無色溶劑（DMSO）、17β-estradiol（100 μg/kg）腹腔注射[13]，1.62 g/kg 左歸丸湯劑灌胃，連續(xù)5 d。第7 天線栓法[14-15]行MCAO 手術(shù)，1 h-MCAO，再灌注24 h。OVX+MCAO+Zuogui Pills+ICI182780 組給予ER 拮抗劑ICI182780（3 mg/kg，腹腔注射）[16]。假手術(shù)組大鼠行無大腦中動(dòng)脈閉塞的假手術(shù)（不栓線）。假手術(shù)組、I/R 組及OVX+I/R 組大鼠均給予等量DMSO 注射液。

MCAO 致麻醉大鼠短暫腦缺血[17]。麻醉后行頸中線切口，將18～19 mm 的單絲插入大腦中動(dòng)脈，以封堵大腦中動(dòng)脈。閉塞1 h 后，通過移除單絲，大腦血流恢復(fù)（再灌注）24 h。再灌注后進(jìn)行神經(jīng)學(xué)評估和新奇物體識(shí)別試驗(yàn)。然后，將腦組織切除并進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.4 模型篩選：神經(jīng)功能缺損評估

再灌注后（第8 天），根據(jù)Garcia 及其同事描述的方法用神經(jīng)功能評分評估神經(jīng)功能缺損[18]。該評估系統(tǒng)由6 個(gè)測試組成，包括自發(fā)活動(dòng)、前爪伸展、四肢運(yùn)動(dòng)的對稱性、振動(dòng)觸覺反應(yīng)、身體本體感覺和攀爬。每個(gè)項(xiàng)目的分?jǐn)?shù)范圍0～3 分，最高分是18 分。

1.5 新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

再灌注后進(jìn)行新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)測試?yán)昧藙?dòng)物天生的傾向，即優(yōu)先探索新事物。簡單地將大鼠置于含有A、B 兩個(gè)相似物體（顏色、大小、形狀）的籠中，在MCAO 前4 d 每天訓(xùn)練20 min。于MCAO 后2 h，大鼠被允許探索對象A 和B，勘探時(shí)間記錄5 min。24 h，對象B 被換做一個(gè)新的物體C，讓大鼠在熟悉的物體A 和陌生的物體C 之間進(jìn)行探索，同樣記錄5 min 物體的探索時(shí)間。在這個(gè)測試中，探索被定義為物理定位/操作和觀察對象（從鼻子到觀察對象的距離＜2 cm）。

1.6 免疫蛋白印跡

腦組織于含1%PMSF 的RIPA 裂解液中冰裂解5 min。4℃，離心，收集上清液測定蛋白濃度。分離的蛋白帶轉(zhuǎn)移到微孔PVDF 膜上。主要抗體在4°C 孵育一夜。抗體有anti-ERα（1∶1000），anti-ERβ（1∶500），anti-BDNF（1∶500），anti-NGF（1∶500），anti-p-CREB（1∶500），anti-TrkB（1∶500），anti-TrkA（1∶500）。HRPlabeled 二抗（1∶5000）在37℃孵育45 min。Gel-Pro 分析儀分析。β-actin（1∶500）被用作內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)功能和認(rèn)知能力比較

與假手術(shù)組比較，I/R 組神經(jīng)功能評分及探索指數(shù)下降（P ＜0.05）。與I/R 組比較，OVX+I/R 組各指標(biāo)下降 （P ＜0.05）。與OVX+I/R 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills 組、OVX+I/R+17β-estradiol 組各指標(biāo)升高（P ＜0.05）；與OVX+I/R+Zuogui Pills 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780 各指標(biāo)下降（P ＜0.05）；OVX+I/R+Zuogui Pills 組與OVX+I/R+17β-estradiol組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠海馬ERα 和ERβ 水平比較

圖1 各組感覺運(yùn)動(dòng)功能和識(shí)別記憶能力比較

ERα、ERβ 表達(dá)在細(xì)胞核，棕黃色為陽性染色。在每張切片海馬區(qū)選擇10 個(gè)表達(dá)強(qiáng)的高倍視野（400×）計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。與假手術(shù)組比較，I/R 組海馬區(qū)ERα和ERβ 水平升高（P ＜0.01）。與I/R 組比較，OVX+I/R組海馬區(qū)ERα 和ERβ 水平下降（P ＜0.01）。與OVX+I/R 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills 組、OVX+I/R+17βestradiol 組海馬區(qū)ERα 和ERβ 水平升高（P ＜0.01）；與OVX+I/R +Zuogui Pills 組 比 較，OVX +I/R +Zuogui Pills+ICI182780 海馬區(qū)ERα 和ERβ 水平下降 （P ＜0.01）；OVX+I/R+Zuogui Pills 組與OVX+I/R+17β-estradiol 組海馬區(qū)ERα 和ERβ 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2～4。

圖2 ERα 在海馬的表達(dá)（DAB 染色，400×）

圖3 ERβ 在海馬的表達(dá)（DAB 染色，400×）

2.3 各組大鼠海馬BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB 和CREB 蛋白及mRNA 水平比較

與假手術(shù)組比較，I/R 組BDNF、NGF、TrkA 蛋白表達(dá)水平升高 （P ＜0.01）；NGF、TrkA mRNA 表達(dá)水平升高（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與I/R 組比較，OVX+I/R組大鼠各指標(biāo)（除CREB 外）水平下降（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與OVX+I/R 組 比 較，OVX+I/R+Zuogui Pills 組、OVX+I/R+17β-estradiol 組各指標(biāo) （除CREB外） 水平升高（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與OVX+I/R+Zuogui Pills 組比較，OVX+I/R+Zuogui Pills+ICI182780組各指標(biāo) （除CREB 外） 水平下降（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與OVX+I/R+Zuogui Pills 組比較，OVX+I/R+17β-estradiol 組各指標(biāo)（除CREB 外）水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖5～6。

3 討論

內(nèi)源性雌激素缺乏會(huì)增加絕經(jīng)后婦女的卒中風(fēng)險(xiǎn)[19]。對于缺血性腦卒中的預(yù)防和治療具有重要意義。本課題組以往研究已經(jīng)證明左歸丸可以改善缺血性腦損傷大鼠的記憶功能[20-21]。本研究結(jié)果同樣顯示，左歸丸能夠減輕OVX 大鼠在MCAO 后感覺運(yùn)動(dòng)功能和識(shí)別記憶的損傷。這個(gè)神經(jīng)保護(hù)作用左歸丸與17β雌二醇相似。

ERα、ERβ，雌激素受體的兩個(gè)重要的亞型，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，生存和新陳代謝，調(diào)節(jié)下游目標(biāo)的表達(dá)[22]。Shin 等[23]研究顯示，ERs 參與了OVX 小鼠MCAO 誘導(dǎo)的缺血性腦損傷。左歸丸是否改善了腦I/R 損傷由調(diào)制ERα 和ERβ 仍不清楚。在本研究對左歸丸預(yù)處理缺血后腦損傷大鼠進(jìn)行ERα 和ERβ 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCAO 手術(shù)不能讓卵巢摘除的大鼠ERα、ERβ 表達(dá)增加，如果補(bǔ)充17β 雌二醇可以上調(diào)ERα 和ERβ 水平。結(jié)果顯示，腦內(nèi)ERs 的升高可能是I/R 損傷的互補(bǔ)效應(yīng)之一。這種互補(bǔ)作用可能由于雌激素缺乏而受到損害引起的。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)左歸丸治療后腦內(nèi)ERα 和ERβ 重新上調(diào)，這種對ER 表達(dá)的刺激作用與17β 雌二醇相似。因此，本研究顯示，與外源性雌激素一樣，左歸丸也通過調(diào)節(jié)ER 信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖4 各組大鼠海馬的ERα 和ERβ 及β-actin 蛋白的免疫印跡圖

圖5 各組大鼠海馬BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB和CREB及β-actin 蛋白的免疫印跡圖

NGF 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophins，NTs），在海馬和皮層中表達(dá)。據(jù)報(bào)道，通過與TrkA 結(jié)合促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活和分化[24]?；钚缘腘GF-TrkA 信號(hào)進(jìn)一步觸發(fā)ERK 的磷酸化，激活其下游蛋白CREB，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的提高[25]。BDNF 是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，最初從豬腦中提取，廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[26]。BDNF 與其受體TrkB 結(jié)合，通過激活下游信號(hào)通路發(fā)揮促神經(jīng)元生存作用[27-28]。此外，往期研究顯示[29-30]，左歸丸可以通過調(diào)節(jié)BDNF和NGF 防治神經(jīng)退行性疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和β-淀粉酶誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。本研究結(jié)果顯示，左歸丸可以激活BDNF-TrkB 和NGF-TrkA 信號(hào)通路。

圖6 各組大鼠海馬BDNF、NGF、TrkA、TrkB、p-CREB和CREB mRNA 水平

已有研究顯示，一種新的植物雌激素可通過ER 依賴的Akt/Nrf2 通路或ER 依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路減輕腦I/R 損傷或新生兒腦缺血缺氧損傷[31-32]。因此推測，左歸丸可能通過ER 依賴的BDNF-TrkB 和NGFTrkA 信號(hào)通路，保護(hù)OVX 大鼠的大腦I/R 損傷。為了研究ERs 在左歸丸神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中的作用，本研究進(jìn)一步使用ER 拮抗劑ICI182780 來阻斷左歸丸存在時(shí)的ER 信號(hào)通路。結(jié)果顯示，ICI182780 注射增加神經(jīng)功能受損和認(rèn)知能力損害，增加腦梗死面積、誘導(dǎo)神經(jīng)元損失，降低ERα/β 水平，抑制了左歸丸對BDNF-TrkB 甚至NGF-TrkA 的促進(jìn)作用。這些數(shù)據(jù)顯示，ER 介導(dǎo)的BDNF-TrkB 和NGF-TrkA 信號(hào)通路是左歸丸神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵通路。