多發(fā)性骨髓瘤患者血清中LncRNA PRAL 的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

張李玉 顧喆贇 周曉丹 王 鈴 陶 健

南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇南通 226001

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是骨髓漿細(xì)胞發(fā)生過(guò)度克隆增殖性疾病，每年MM 發(fā)病例數(shù)達(dá)12 萬(wàn)人，占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的12%，近年來(lái)其發(fā)病率有逐漸增加的趨勢(shì)[1-2]。深入研究MM 的疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的診斷及治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床價(jià)值[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）PRAL 基因位于17p13.1，是一種調(diào)控抑癌基因P53 相關(guān)LncRNA，參與正常細(xì)胞的發(fā)育分化、細(xì)胞增殖凋亡等過(guò)程的調(diào)控[4]。研究表明，LncRNA PRAL 在非小細(xì)胞肺癌[4]、肝癌[5]等腫瘤中均存在異常表達(dá)降低的現(xiàn)象，進(jìn)而抑制下游靶基因P53 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，在MM 原代細(xì)胞及MM 細(xì)胞系中存在LncRNA PRAL 表達(dá)降低的現(xiàn)象，是MM 重要的診斷治療的分子靶點(diǎn)。目前MM 患者血清中LncRNA PRAL 的表達(dá)水平及臨床意義報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)MM 患者血清中LncRNA PRAL 表達(dá)水平，分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月—2017 年1 月南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）診治的82 例MM 患者臨床資料作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)M 診斷符合2003 年國(guó)際骨髓瘤工作組（IMWG）MM 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。②臨床病理和隨訪資料均完整。③患者及其家屬對(duì)本研究知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤病史或治療史。②合并白血病、淋巴瘤等其他血液系統(tǒng)疾病。③合并肺炎、結(jié)核等感染性疾病。④神經(jīng)精神障礙，不能配合治療或隨訪者。⑤以往接受過(guò)其他治療。男46 例，女36 例；年齡37～73 歲，平均（58.4±6.7）歲；按照國(guó)際分期系統(tǒng)（ISS）[8]進(jìn)行分期，其中Ⅰ期（β2-MG≤3.5 mgL，白蛋白＞35 g/L）14 例，Ⅱ期（3.5 mgL<β2-MG＜5.5 mg/L）32 例，Ⅲ期（β2-MG≥5.5 mg/L）36 例；D-S 分期：Ⅰ期13 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期51 例；診斷分型：IgG 型34 例，IgA 型27 例，輕鏈型及其他型21 例；血紅蛋白＜100 g/L 53 例，≥100 g/L 29 例；血鈣＜2.98 mmol/L 61 例，≥2.98 mmol/L 21 例；乳酸脫氫酶＜245 U/L 60 例，≥245 U/L 22 例。以血清LncRNA PRAL 表達(dá)的平均值2.125 為界，分為高LncRNA PRAL表達(dá)組40 例和低LncRNA PRAL 表達(dá)組42 例。以我院同期診治的50 例罹患其他血液疾病患者作為病例對(duì)照組，男28 例，女22 例；年齡40～73 歲，平均（57.5±6.4）歲；非霍奇金淋巴瘤16 例，急性淋巴細(xì)胞白血病17 例，慢性粒細(xì)胞白血病17 例。診斷均符合2007 年《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》[9]。51 名我院同期健康體檢的健康人群作為健康對(duì)照組，其中男27 名，女24 名；年齡39～72 歲，平均（56.6±6.5）歲。三組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 治療療效評(píng)價(jià)及隨訪

82 例MM 患者均接受以硼替唑米為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案誘導(dǎo)治療，硼替唑米用藥劑量為1.3 mg/m2，共4 個(gè)療程?；煼桨赴˙AD 方案（硼替佐米+多柔比星+地塞米松）、BADT 方案（硼替佐米+多柔比星+地塞米松+沙利度胺），維持治療方案為沙利度胺，劑量50 mg/d，2 次/周，維持2 年。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用歐洲血液及骨髓移植協(xié)作組制訂的歐洲骨髓移植協(xié)作組（EBMT）標(biāo)準(zhǔn)[10]，主要分為完全緩解、部分緩解、病情穩(wěn)定、疾病進(jìn)展。

隨訪：自患者出院之日起開(kāi)始隨訪，隨訪截止至2020 年1 月，以門診或電話方式進(jìn)行隨訪，1 次/月，隨訪內(nèi)容為患者生存情況，隨訪終止時(shí)間為患者發(fā)生死亡事件或隨訪時(shí)間結(jié)束。

1.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)各組血清中LncRNA PRAL 表達(dá)

取各組清晨空腹靜脈血約5 mL，EDTA 抗凝，4℃1200 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，將上層血清-80℃保存待測(cè)。取200 μL 樣品，Trizol 法提取血清中總RNA，Narodrop 鑒定RNA 的濃度及純度。以1 μg RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應(yīng)用SYBR Premiers Ex Taq Kit（TaKaRa 公司）試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：DRR041）在ABI PRISM 7900 qRT-PCR 儀上（ABI 公司，美國(guó)）進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為5×primerScript Buffer 2 2 μL，PrimerScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，模板10 μL，頸環(huán)引物1 μL，加入DEPC 水補(bǔ)足至20 μL體系?？偡磻?yīng)體系：2×Master Mix 10 μL，上游及下游引物分別1 μL，cDNA 1μl，無(wú)RNA 酶水7 μL。反應(yīng)條件為：95℃2 min，95℃20 s，60℃20 s，70℃20 s，39 個(gè)循 環(huán)。LncRNA PRAL 正 向 引 物 序 列：5′-GGCA GAGTCT-CGCTTGGT-3′，反向引物序列：5′-GAAACTCCGTCTCCGCTAA-3′；內(nèi)參基因GAPDH 正向引物序列：5′-CGGATTTGG-TCGTATTGGG-3′，反向引物序列：5′-CTGGAAGAT-GGTGATGGGATT-3′。結(jié)果采用2-ΔΔCt值方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中ΔCt=CtLncRNAPRAL-CtGAPDH。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 生存分析病例組不同LncRNA PRAL 表達(dá)患者生存預(yù)后的差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中LncRNA PRAL 表達(dá)比較

病例組、病例對(duì)照組和健康對(duì)照組血清中LncRNA PRAL 的相對(duì)表達(dá)量分別為（2.125±0.127）、（4.065±0.153）、（4.117±0.161），病例組患者血清中LncRNA PRAL的相對(duì)表達(dá)量明顯低于病例對(duì)照組及健康對(duì)照組（t=79.005、80.045，P=0.000、0.000），而病例對(duì)照組與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.663，P=0.099）。

2.2 MM 病例組血清中LncRNA PRAL 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

MM 病例組不同ISS 分期患者血清中LncRNA PRAL 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而患者不同年齡、性別、D-S 分期、診斷分型、血乳酸脫氫酶、血鈣及血紅蛋白水平血清中LncRNA PRAL的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 不同LncRNA PRAL 表達(dá)患者的治療效果比較

MM 病例組LncRNA PRAL 高表達(dá)組的效果優(yōu)于LncRNA PRAL 低表達(dá)組（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 不同LncRNA PRAL 表達(dá)患者預(yù)后差異

本研究中，82 例MM 病例組隨訪時(shí)間4～36 個(gè)月，平均（35.1±5.7）個(gè)月，隨訪期間無(wú)失訪病例。截止至隨訪時(shí)間結(jié)束時(shí)，死亡患者例數(shù)為31 例，高LncRNA PRAL表達(dá)組及低表達(dá)組的3 年總體生存率分別為75.0%（30/40）、50.0%（21/42），平均生存時(shí)間分別為（33.1±6.2）、（29.6±5.9）個(gè)月。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果提示，血清LncRNA PRAL 低表達(dá)組的3 年OS 明顯低于高表達(dá)組（χ2=5.143，P=0.014），LncRNA PRAL低表達(dá)組平均生存時(shí)間明顯短于高表達(dá)組（t=2.619，P=0.011）。見(jiàn)圖1。

表1 MM 病例組血清中LncRNA PRAL 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表1 MM 病例組血清中LncRNA PRAL 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

注：MM：多發(fā)性骨髓瘤；IgG：免疫球蛋白G；IgA：免疫球蛋白A；ISS分期：多發(fā)骨髓瘤國(guó)際分期系統(tǒng)；D-S 分期：Durie-Salmon 分期

表2 不同LncRNA PRAL 表達(dá)患者的治療療效比較（例）

圖1 不同LncRNA PRAL 表達(dá)患者3 年總體生存率差異

3 討論

MM 是分泌產(chǎn)生M 蛋白的漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，MM 細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致患者出現(xiàn)廣泛的骨質(zhì)病變、腎功能損傷、貧血、高鈣血癥等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重威脅人類健康[11]。目前MM 的治療包括化療、免疫調(diào)節(jié)因子、蛋白酶體抑制劑及自體造血干細(xì)胞移植等，雖然延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，但均無(wú)法徹底根治。有研究報(bào)道，常規(guī)VAD 或MP 的聯(lián)合化療方案治療MM 患者的完全緩解率不足10%[12]。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，MM 的發(fā)病是一個(gè)逐漸變化的過(guò)程，非編碼RNA 在MM 的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控功能，能夠影響漿細(xì)胞的分化發(fā)育、增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程，是MM 疾病進(jìn)展的重要調(diào)控分子[13]。

近年來(lái)研究表明[14-16]，LncRNA 參與基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、干細(xì)胞功能調(diào)控及熱休克等病理生理過(guò)程，與炎癥、免疫及腫瘤等疾病關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PRAL 基因的異常表達(dá)參與調(diào)控P53 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，并且與肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PRAL 與MM 患者的預(yù)后及化療耐藥性有關(guān)，可能成為MM 新的診斷治療靶點(diǎn)[18]。本研究中，MM 病例組血清中LncRNA PRAL表達(dá)較低，其機(jī)制可能與MM 發(fā)生時(shí)LncRNA PRAL的編碼基因缺失型突變有關(guān)。研究[19]表明，腫瘤發(fā)生時(shí)，LncRNA PRAL 的基因位點(diǎn)是17p13.1，而17 號(hào)染色體長(zhǎng)臂的缺失型突變17（del）較為常見(jiàn)，導(dǎo)致LncRNA PRAL 基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平顯著降低。此外，本研究中ISS 分期越高，MM 患者血清中LncRNA PRAL表達(dá)水平越高。其機(jī)制可能是，LncRNA PRAL 表達(dá)缺失能夠抑制P53 蛋白由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，抑制P53的功能，導(dǎo)致MM 惡性增殖，凋亡減少，MM 細(xì)胞分泌大量β2-MG，導(dǎo)致ISS 分期升高。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)亦表明，腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LncRNA PRAL 能夠促進(jìn)P53蛋白的表達(dá)，并顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[20]。本研究中，病例組LncRNA PRAL 高表達(dá)組療效優(yōu)于LncRNA PRAL 低表達(dá)組。研究報(bào)道，LncRNA PRAL 表達(dá)降低時(shí)，其結(jié)合并抑制miR-210 的能力降低，抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的表達(dá)，導(dǎo)致硼替佐米促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生BMP2 的能力下降，抑制多能造血干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，加重骨質(zhì)破壞[21-22]。有學(xué)者報(bào)道，LncRNA的表達(dá)水平與肺癌、肝癌及卵巢癌等腫瘤患者的生存預(yù)后關(guān)系密切[23-25]。本研究中，血清LncRNA PRAL 低表達(dá)組3 年OS 明顯低于高表達(dá)組，平均生存時(shí)間亦明顯較短，提示血清LncRNA PRAL水平有可能成為判斷MM 患者生存預(yù)后的血清標(biāo)志物。

綜上所述，MM 患者血清中LncRNA PRAL 表達(dá)降低，血清中LncRNA PRAL 表達(dá)與ISS 分期有關(guān)，血清低表達(dá)LncRNA PRAL 的MM 患者以硼替佐米為初始治療的化療的完全緩解率較低。血清低表達(dá)LncRNA PRAL 的MM 患者的生存預(yù)后較差。因此，LncRNA PRAL 參與MM 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有可能成為評(píng)估MM 預(yù)后的重要指標(biāo)。