蒲黃的過篩凈制研究

劉亞萍 高明亮 陳佩東 周桂生

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲（Typha angustifolia L.）或同屬植物的干燥花粉。每年6～7 月份，采集蒲棒頂部黃色雄花序，制備成草蒲黃。草蒲黃進(jìn)一步經(jīng)過碾軋和篩取等工藝去除雜質(zhì)制備成蒲黃[1]。我國的蒲黃資源非常豐富，全國各地都有分布[2]。蒲黃始載于神農(nóng)本草經(jīng)，在中醫(yī)臨床中有著廣泛的應(yīng)用，有炒蒲黃和蒲黃炭等不同炮制品，是化瘀止血的重要藥物[3-4]。生蒲黃飲片常用于淤血所致的經(jīng)閉痛經(jīng)、脘腹疼痛等，而炒蒲黃和蒲黃炭飲片則主要用于各類出血病癥[5]。

蒲黃中主要含有黃酮類、甾體類、有機(jī)酸類及腦苷和多糖等成分[6-9]?，F(xiàn)代研究表明，蒲黃中的黃酮類化合物具有化瘀、抗氧化[10-11]作用、蒲黃具有抗動脈硬化，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功效[12]以及干預(yù)凝血系統(tǒng)作用[13-14]。為了保證蒲黃的質(zhì)量，控制飲片中非花粉的數(shù)量，《中國藥典》[1]規(guī)定蒲黃中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量要大于0.5%。但是目前市售蒲黃飲片摻偽現(xiàn)象依然嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊[15-16]。因此本研究對蒲黃飲片凈制方法進(jìn)行探討，對篩制后的花粉粒及雜質(zhì)中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量進(jìn)行測定，為蒲黃飲片的質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent1290）；日立S-4800 型掃描電鏡（日本東京）；MS-105DU 型電子天平（Mettler Toledo，萬分之一）。紗篩購自浙江上虞市道墟張興紗篩廠。

1.2 試藥

蒲黃樣品采集于南京棲霞區(qū)廟山湖南側(cè)（118°58′14.39″E，32°04′52.69″N），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張瑜副教授鑒定為水燭香蒲。香蒲新苷（Y14S 8H43976）和異鼠李素-3-O-新橙皮苷（H30M3X1）對照品購自源葉生物科技有限公司。乙腈（默克公司，SHBK5734）、甲醇（江蘇漢邦科技有限公司，180975）及磷酸（阿拉丁，C1801089）均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒲黃過篩樣品制備

取蒲黃樣品過篩并稱重，花粉過6～8 號篩平均得率分別為98.30%、95.13%和91.57%。

2.2 蒲黃掃描電鏡觀察

蒲黃用FAA 固定液脫水處理后用掃描電鏡檢查，可見蒲黃中混有纖維、植物碎屑以及一些極小的微粒。見圖1。

圖1 蒲黃樣品掃描電鏡

2.3 對照品和供試品溶液的制備

對照品溶液制備方法：分別稱取香蒲新苷及異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品約10 mg，精密稱定后置10 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容，既得。供試品溶液制備方法：分別稱取樣品約0.5 g，精密稱定后置于具塞錐形瓶中。精密量取甲醇50 mL 并稱定重量，先冷浸12 h，再加熱回流1 h，放冷后再稱定重量。以甲醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻后過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 蒲黃花粉粒與雜屑中黃酮化合物的含量測定

2.4.1 色譜條件 采用PRAZIS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）為流動相梯度洗脫。梯度設(shè)置為0～5 min，5.0%～14.0%A；5～10 min，14.0%～32.0%A；10～15 min，31.5%A；15～40 min，31.5%～45.0%A；40～43 min，45.0%～5.0%A；43～46 min，5.0%A。流速設(shè)置為1.0 mL/min，柱溫設(shè)置為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取對照品溶液及供試品溶液按以上“2.4.1”中色譜條件進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在供試品溶液的色譜圖中，出現(xiàn)與對照品相同位置的峰，且組分之間分離較好。見圖2。測試的供試品溶液理論塔板數(shù)按異鼠李素-3-O-新橙皮苷計(jì)不低于5000。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密稱取各對照品，分別制備成濃度為48.10、30.96 μg/mL 的香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷母液。再分別吸取以上各母液25、50、100、200、400 μL 至2 mL 容量瓶中，加甲醇溶液至刻度定容。密塞，搖勻后按“2.4.1”中色譜條件進(jìn)行測定。各對照品濃度設(shè)為橫坐標(biāo)X，將峰面積設(shè)為縱坐標(biāo)Y得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。香蒲新苷的回歸方程為Y=11.665X-3.0371，r=0.9998；異鼠李素-3-O-新橙皮苷回歸方程為Y=14.729X-2.4082，r=0.9998。香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷分別在0.7516～48.1000 μg/mL和0.4338～30.9600 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。

圖2 蒲黃及過篩雜質(zhì)的高效液相色譜圖

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一蒲黃供試品溶液，按上述“2.4.1”中色譜條件測定6 次，分別計(jì)算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的峰面積，結(jié)果以上2 種成分的RSD 分別為0.71%和0.75%，表明儀器精密度良好。對照品的檢測限分別為0.1259 μg/mL 和0.3788 μg/mL；定量限分別為0.3223 μg/mL 和0.0252 μg/mL。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批蒲黃按上述供試品溶液制備的方法制備。吸取樣品，重復(fù)測定6 次，計(jì)算其中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的峰面積。結(jié)果香蒲新苷平均含量為3.72 mg/g，RSD 為0.82%，異鼠李素-3-O-新橙皮苷為2.99 mg/g，RSD 為1.07%，表明此方法重復(fù)性較好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在室溫條件下，按上述色譜條件對蒲黃樣品進(jìn)行測定，分別于0、2、4、6、12 h 計(jì)算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.64%和0.59%，表明蒲黃樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取蒲黃同一批次樣品6 份，每份取樣量約為0.25 g，按前述供試品溶液制備的方法，分別精密加入已知量的對照品，進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 加樣回收測定結(jié)果

2.4.8 樣品含量測定 精密稱取三批樣品按照“2.3”中供試品溶液的制備方法以及上述“2.4.1”中色譜條件測定，每批樣品測定3 次，計(jì)算其中所含香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量。見表2。

2.3 討論

蒲黃在采收、制備時會混有雌花序、花蕊等雜質(zhì)，常有細(xì)小雜質(zhì)[17]。目前飲片市場中的蒲黃飲片，?；煊谢ńz及纖維的混合物，存在著不合格產(chǎn)品[18-19]。由于蒲黃飲片中參入雜質(zhì)較多，影響了顏色，有些飲片又參入了一些染色劑[20-21]。在本實(shí)驗(yàn)中，所檢測樣品中除花粉粒外，還有纖維導(dǎo)管及花絲、苞片等植物碎片。在這些碎片上，還可以觀察到黏附的一些微小顆粒狀物質(zhì)。由于6～8 號篩的孔徑遠(yuǎn)大于花粉粒直徑，可篩除花粉粒中混雜的植物碎片。從含量測定結(jié)果可以看出，樣品過篩后，黃酮類化合物含量顯著增高。其中，過7 號篩后香蒲新苷等化合物的含量最高，原因可能是在過8 號篩時，有一部分花粉粒黏附到雜質(zhì)上，造成損失。同時，本研究對過篩后的雜質(zhì)進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明，雜質(zhì)中也含有一些黃酮類成分。

表2 過篩后花粉粒及雜質(zhì)中黃酮化合物含量（n=3）

研究表明，蒲黃飲片造假主要是添加非藥用部位，一般通過7 號篩能去除絕大部分雜質(zhì)[22]。評價蒲黃飲片及其復(fù)方制劑品質(zhì)的方法主要是測定其中的黃酮苷類化合物[23-24]。在蒲黃炒炭的加熱炮制的過程中，可以通過熱力動力學(xué)對炮制工藝進(jìn)行設(shè)定[25]。但是由于花粉壁與植物纖維等組成不同，受熱分解的溫度有差異，所以蒲黃中的非藥用部位對炮制也有影響，造成炮制品質(zhì)量不穩(wěn)定。

本研究結(jié)果表明，所測定樣品中黃酮類成分符合藥典的規(guī)定。但是，經(jīng)過進(jìn)一步過篩凈制，黃酮化合物含量顯著增加。所以，過篩對蒲黃飲片質(zhì)量控制具有重要意義。