植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究進(jìn)展

李益 孫超

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

生物體由不同形態(tài)、具有特定功能的細(xì)胞構(gòu)成，而不同細(xì)胞的基因表達(dá)模式也是不同的［1］。常規(guī)的植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究通常是將植物整個(gè)器官或組織均質(zhì)化后測序，忽略了細(xì)胞的異質(zhì)性［2］，雖然有助于在器官或組織水平上解決許多生物學(xué)問題，但無法了解稀有細(xì)胞類型或單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程。細(xì)胞捕獲、測序技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展使得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（Single-cell RNA-seq，scRNA-seq）成為可能，并不斷發(fā)展和完善，目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并在植物學(xué)研究中顯示出巨大的潛力。在植物中開展單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究有助于深入理解不同細(xì)胞類型在發(fā)育過程中的作用以及細(xì)胞間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［3］。本文對(duì)植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在植物研究中的應(yīng)用進(jìn)行了概述。

1 植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

scRNA-seq技術(shù)發(fā)展迅猛，從最初只能檢測幾個(gè)細(xì)胞到單次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)檢測數(shù)10萬個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)效率得到了顯著提高［4］。同時(shí)，建庫及測序過程中不同環(huán)節(jié)的改進(jìn)使得成本不斷降低、有效信息量不斷增加。目前已經(jīng)開發(fā)出多種scRNA-seq技術(shù)，不同技術(shù)的適用范圍不同。多孔板法（PCR platebased）和液滴法（Droplet-based）是兩類成功應(yīng)用于植物研究的scRNA-seq技術(shù)（表1）。兩類方法各有特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮椭参飿颖拘再|(zhì)選擇合適的技術(shù)方法［5］。

表1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)

1.1 多孔板法

對(duì)于稀有類型細(xì)胞或者細(xì)胞量較少的樣本，可以考慮多孔板法。因此，基于多孔板法的scRNAseq技術(shù)適用于研究特定類型或稀有的細(xì)胞，如生殖細(xì)胞。通常結(jié)合毛細(xì)管口吸法、激光顯微切割或流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)來分選單個(gè)細(xì)胞［6］。這種方法首先需要將少量的細(xì)胞分選到含有PCR引物的64/96孔板中，然后對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立構(gòu)建測序文庫并測序［7］?；诙嗫装宓姆椒ㄗ畲蟮膬?yōu)點(diǎn)是捕獲效率高，但由于其細(xì)胞通量較低，測序成本高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。目前在植物中成功開展應(yīng)用的有Smartseq2［8］和CEL-seq2［9］。Smart-seq2支 持 全長轉(zhuǎn)錄本測序，靈敏度高，是檢測低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的最佳選擇［10］。CEL-seq2采用體外轉(zhuǎn)錄線性擴(kuò)增（IVT）的建庫方法，主要優(yōu)勢是減少了PCR指數(shù)擴(kuò)增所造成的偏差，擴(kuò)增后DNA的雙端深度測序能夠準(zhǔn)確檢測兩條鏈的序列［11］。

1.2 液滴法

基于液滴法的scRNA-seq通過微流控芯片，利用液滴直接分選單個(gè)細(xì)胞，可以無差別獲得組織中上千個(gè)細(xì)胞，使得植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究實(shí)現(xiàn)了從少量細(xì)胞到高通量的飛躍［12-13］。2015年，哈佛大學(xué)的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)將微流控技術(shù)引入scRNA-seq中，分別開發(fā)出 Drop-seq［14］和inDro［15］兩種技術(shù)。隨后，10× Genomics 公司于2017 年推出一個(gè)基于液滴法的商業(yè)化單細(xì)胞分析系統(tǒng)Chromium，使得scRNAseq的應(yīng)用得到了迅速發(fā)展。2019年，先后有多篇文章報(bào)道利用Chromium 平臺(tái)對(duì)擬南芥根開展了研究，證明了高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序同樣可用于研究植物［16-20］?；谝旱畏ǖ膕cRNA-seq都運(yùn)用了相似的技術(shù)原理，在微流控設(shè)備中，水流中包含懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞，裂解緩沖液中包含了用條碼（Barcodes）標(biāo)記的微珠，這兩股流體匯集在一起后穿過油體通道，最終形成一個(gè)個(gè)油滴包裹的凝膠珠。一旦液滴包裹成功，細(xì)胞立即被裂解，釋放出與微珠表面引物結(jié)合的 RNA，在微珠表面反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，生成包含成千上萬個(gè)單細(xì)胞的 cDNA 文庫［21-22］。

2 植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析流程

相比于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序，scRNA-seq產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量更為龐大復(fù)雜，分析和解釋數(shù)據(jù)也是scRNAseq分析中的重點(diǎn)［23］。scRNA-seq分析的具體步驟可能會(huì)由于生物學(xué)問題不同而有所不同，但大多數(shù)分析中使用的核心流程是一致的，包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)的降維和聚類以及數(shù)據(jù)下游分析3部分［24-26］（圖1）。

圖1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

數(shù)據(jù)的預(yù)處理包括數(shù)據(jù)的質(zhì)控、數(shù)據(jù)矯正和整合以及對(duì)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理3部分［27-30］。細(xì)胞異常破裂、死亡、捕獲細(xì)胞的位置沒有細(xì)胞或者含有多個(gè)細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生低質(zhì)量數(shù)據(jù)，因此在正式分析前需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制以剔除這部分?jǐn)?shù)據(jù)［31］。數(shù)據(jù)整合可以消除實(shí)驗(yàn)過程中的生物因素、技術(shù)因素以及不同批次引起的數(shù)據(jù)偏差，盡可能地展示單個(gè)細(xì)胞的真實(shí)表達(dá)情況［32-33］。通過多步過濾的數(shù)據(jù)即可用于構(gòu)建高精度的基因-細(xì)胞表達(dá)矩陣，用于后續(xù)分析。

2.2 降維和聚類分析

scRNA-seq數(shù)據(jù)具有高維性，涉及數(shù)千個(gè)基因和大量細(xì)胞，當(dāng)在一個(gè)高維基因表達(dá)空間中比較細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞間的距離變得更加均勻，使得區(qū)分群體間或者群體內(nèi)的差異非常困難。首先在數(shù)千個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)中，選取其中高度可變的基因（Highly variable genes，HVGs），比使用所有的基因，選擇HVGs更為有效［26，34］。然后采取主成分分析（Principal component analysis，PCA）降低數(shù)據(jù)集的高緯度和復(fù)雜度，PCA可將數(shù)據(jù)投射到較少的獨(dú)立的線性維度中，從而捕捉到可能的最大方差。采用t分布隨機(jī)領(lǐng)域嵌入（t-Distributed stochastic neighbor embedding，tSNE）或均勻流形近似和投影（Uniform manifold approximation and projection，UMAP）對(duì) 細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步降維，這兩種都是非線性降維方法，可以有效地將高維度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成二維圖像［35-36］。PCA降維后的數(shù)據(jù)傳遞到t-SNE與UMAP進(jìn)行二維可視化展示，細(xì)胞之間的基因表達(dá)模式越相似，在t-SNE/UMAP圖中的距離也越接近。接下來可采用k-means算法或圖聚類算法（Graph-based）進(jìn)行聚類分析，將表達(dá)相似的細(xì)胞聚在一起，形成不同的細(xì)胞亞群［24，37］（Cell cluster）。Seurat是用于分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)的常用軟件，它使用基于圖聚類的算法，通過計(jì)算細(xì)胞間的差異性，優(yōu)化細(xì)胞間聚類關(guān)系距離的權(quán)重值（通過設(shè)定軟件中的閾值），實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的聚類。

2.3 數(shù)據(jù)下游分析

數(shù)據(jù)下游分析包含細(xì)胞水平和基因水平的分析［25］。細(xì)胞水平的分析又分為細(xì)胞類型鑒定和軌跡分析，其中也涉及到基因水平的分析?；蛩椒治霭ú町惐磉_(dá)分析、基因集分析和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。目前，主要有兩種方法用于鑒定細(xì)胞類型，一種是人工鑒定方法，綜合利用樣本信息、組織類型、細(xì)胞狀態(tài)、表面marker和差異表達(dá)基因，并結(jié)合已知數(shù)據(jù)庫的信息，進(jìn)行細(xì)胞類型注釋［38］。CellMarker［39］和panglaodb［40］是兩個(gè)常用數(shù)據(jù)庫，提供了人和小鼠細(xì)胞注釋集。對(duì)于其他物種，則需要根據(jù)報(bào)道的文獻(xiàn)來確定標(biāo)記基因（marker基因）。另一種方法是利用自動(dòng)化鑒定工具對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注釋，目前，已經(jīng)開發(fā)出近30種自動(dòng)化鑒定工具，包 括Scamp［41］、SingleR［42］、cellassign［43］等。自動(dòng)化工具利用已知類型的細(xì)胞樣本的基因表達(dá)譜以及marker基因作為參考數(shù)據(jù)集，基于單細(xì)胞與參考數(shù)據(jù)集表達(dá)譜的相似性，對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行自動(dòng)化注釋。細(xì)胞聚類、注釋、重新聚類或子聚類以及重新注釋過程的反復(fù)迭代非常耗時(shí)，自動(dòng)化鑒定方法提高了細(xì)胞注釋的效率，但也降低了其準(zhǔn)確性。對(duì)于較小的數(shù)據(jù)集，可以優(yōu)先考慮人工注釋的方法，隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序樣本數(shù)和細(xì)胞數(shù)的增加，可以結(jié)合多種方法，如首先使用自動(dòng)化工具進(jìn)行粗略注釋，然后利用人工注釋對(duì)結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充完善。在分選單細(xì)胞的過程中可以捕獲到處于中間狀態(tài)的細(xì)胞（從一種狀態(tài)到另一種狀態(tài)的細(xì)胞），scRNA-seq提供了一個(gè)很好的機(jī)會(huì)來組裝發(fā)育過程中的演化軌跡。在細(xì)胞的演化進(jìn)程中，細(xì)胞的轉(zhuǎn)變可能表現(xiàn)出不同的速率，意味著不應(yīng)隨著時(shí)間來評(píng)估基因表達(dá)的變化，而是應(yīng)該依賴于發(fā)育過程中的進(jìn)展。擬時(shí)（Pseudotime）分析，又稱細(xì)胞軌跡（Cell trajectory）分析，根據(jù)測序細(xì)胞之間表達(dá)模式的相似性對(duì)單細(xì)胞沿著軌跡進(jìn)行排序，以此推斷出發(fā)育過程細(xì)胞的分化軌跡或細(xì)胞亞型的演化過程［44］。Saelens等［45］對(duì)45種軌跡推斷方法的準(zhǔn)確性、可擴(kuò)展性、穩(wěn)定性和可用性4個(gè)方面進(jìn)行了比較，評(píng)估結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)前軌跡推斷方法之間存在很大的互補(bǔ)性，不同的工具有不同的使用范圍。Monocle是一款常用的擬時(shí)分析軟件，其計(jì)算細(xì)胞的相關(guān)性得到最小生成樹，找到最小路徑，然后把其他的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)投射到最小路徑，最終得到細(xì)胞分化軌跡圖的算法［46-47］。

基因水平上的分析主要是通過比較細(xì)胞亞型之間差異基因的表達(dá)和功能富集，從而進(jìn)一步解釋細(xì)胞的異質(zhì)性［48］。差異基因分析實(shí)際上是貫穿單細(xì)胞研究的重點(diǎn)分析內(nèi)容，亞群特征基因分析、處理組之間的基因動(dòng)態(tài)變化、分化路徑上的基因動(dòng)態(tài)變化，本質(zhì)上都是差異基因分析。目前的基因差異表達(dá)分析軟件有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，Wang等［49］對(duì)比了11種基因差異表達(dá)分析軟件發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的基因差異分析工具（DESeq2，edgeR）與單細(xì)胞差異分析工具性能表現(xiàn)相當(dāng)，尤其在檢測靈敏度上表現(xiàn)良好，但此類軟件的運(yùn)行時(shí)間較長，對(duì)于大數(shù)據(jù)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因差異分析來說，算法的運(yùn)行時(shí)間通常是一種重要的考慮因素。在單細(xì)胞差異表達(dá)分析工具中，DEsingle［50］和SigEMD［51］可以同時(shí)保證檢測靈敏性和準(zhǔn)確性，但是運(yùn)行效率仍然比較低。另外，MAST（Model-based Analysis of Single-cell Transcriptomics）軟件利用hurdle模型消除dropout（基因在某些細(xì)胞完全沒有表達(dá)，同時(shí)在另外一些細(xì)胞有高表達(dá)的現(xiàn)象）的影響，在性能和效率上可以達(dá)到較好的平衡［25，52］。

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在植物研究中的應(yīng)用

基于多孔板法的scRNA-seq可用于研究稀有細(xì)胞，Efroni等［8］和Nelms等［9］分別利用Smart-seq2和Cell-seq2捕捉到了愈傷組織和生殖細(xì)胞在進(jìn)入分化階段前的瞬時(shí)變化?；谝旱畏ǖ膕cRNA-seq，尤其是Chromium平臺(tái)的高細(xì)胞通量為植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究帶來了新的突破口，使得研究樣本從少量細(xì)胞向組織器官轉(zhuǎn)變?？偟膩碚f，scRNA-seq可以通過捕獲單個(gè)細(xì)胞的基因的表達(dá)情況（表2），來揭示細(xì)胞的異質(zhì)性，細(xì)胞的分化軌跡以及細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制。

表2 植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究概況

3.1 鑒定細(xì)胞類型

2019年2 月，首篇利用高通量單細(xì)胞測序的植物根尖單細(xì)胞圖譜文章發(fā)表在Plant Physiology上。Ryu等［16］選擇擬南芥幼苗根尖組織為樣本，利用Chromium平臺(tái)，共獲得了7552個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過Seurat對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行降維聚類分析，得到9個(gè)主要的細(xì)胞亞群，隨后利用86個(gè)已知特異性表達(dá)的標(biāo)記基因集對(duì)不同的細(xì)胞亞群進(jìn)行注釋，同樣地，利用木質(zhì)部和韌皮部標(biāo)記基因集區(qū)分了中柱細(xì)胞內(nèi)的不同細(xì)胞亞型，證實(shí)了高通量scRNA-seq在植物研究中的可行性和有效性。Denyer等［17］選用了相同的測序平臺(tái)對(duì)擬南芥根組織進(jìn)行了測序，利用相似的有監(jiān)督分類方法注釋細(xì)胞類型，并構(gòu)建了含報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，結(jié)果顯示內(nèi)皮層組織內(nèi)的細(xì)胞確實(shí)有報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)。有監(jiān)督分類方法僅適用于極少數(shù)有參考數(shù)據(jù)集的植物，作者還采用了無監(jiān)督分類方法，通過定義聚簇中特異性的標(biāo)記基因標(biāo)準(zhǔn)，在聚簇之間的差異基因集中進(jìn)行篩選，獲取了數(shù)百個(gè)自定義的標(biāo)記基因，并從中挑選了10個(gè)特異性高且此前未報(bào)導(dǎo)過與根發(fā)育相關(guān)的標(biāo)記基因，通過報(bào)告基因株系進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，有8個(gè)基因的表達(dá)模式與預(yù)測一致。有關(guān)擬南芥根組織的研究結(jié)果表明，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)可以鑒別不同細(xì)胞類型，如中柱鞘細(xì)胞、韌皮部篩管和不同表皮細(xì)胞亞型，也能檢測到靜止中心（Quiescent centre，QC）這種數(shù)目稀少的細(xì)胞群。

3.2 揭示細(xì)胞分化軌跡

利用擬時(shí)序分析可以推導(dǎo)出具有分化/演化關(guān)系的細(xì)胞亞群間可能的分化路徑。Shulse等［54］通過Monocle推斷了內(nèi)皮層細(xì)胞的發(fā)育過程，結(jié)果顯示發(fā)育早期的細(xì)胞亞群沿著兩支軌跡曲線分化。與內(nèi)皮層發(fā)育相關(guān)的798個(gè)基因在擬時(shí)間序列上呈現(xiàn)早期、中期、晚期3種表達(dá)模式，且調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分化初始階段的相關(guān)基因在擬時(shí)間序列的早期階段表達(dá)，而晚期表達(dá)的基因主要與木質(zhì)素代謝和細(xì)胞連接組分合成相關(guān)。對(duì)多項(xiàng)擬南芥單細(xì)胞的研究，同樣利用Monocle解析了根組織中的表皮［16］、內(nèi)皮層［54］、根毛［56］、分生組織［17］、根冠［19］細(xì)胞分化軌跡和各類細(xì)胞分化過程中基因的動(dòng)態(tài)變化。Nelms［9］收集了玉米的144個(gè)生殖細(xì)胞，通過單細(xì)胞分析重塑了玉米雄性細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的發(fā)育過程。在減數(shù)分裂前期，轉(zhuǎn)錄組圖譜發(fā)生了兩次急劇變化，通過比較轉(zhuǎn)錄組圖譜與染色體細(xì)胞形態(tài)學(xué)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)變發(fā)生在第一次減數(shù)分裂前期的細(xì)線期，第二個(gè)轉(zhuǎn)變發(fā)生在偶線期，表明減數(shù)分裂期間轉(zhuǎn)錄表達(dá)的改變不僅與核事件相關(guān)，而且與細(xì)胞形態(tài)相關(guān)。通過擬時(shí)序分析還能找出驅(qū)動(dòng)細(xì)胞亞群分化的關(guān)鍵基因。分生組織到根毛細(xì)胞的發(fā)育過程中的基因表達(dá)譜顯示，與根毛發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞擴(kuò)張和細(xì)胞重組的基因在擬時(shí)間序列的中期表達(dá)，以此推測這些基因可能是驅(qū)動(dòng)根毛分化的特定基因。Turco等［55］研究木質(zhì)部細(xì)胞分化到終端分化的分子機(jī)制，基于全根表達(dá)譜數(shù)據(jù)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)，表明了VND7是啟動(dòng)根細(xì)胞向木質(zhì)部細(xì)胞急劇轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子，確定了4個(gè)候選VND7下游靶基因。

3.3 分析細(xì)胞間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

高通量scRNA-seq技術(shù)的可提供單細(xì)胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組信息，有助于發(fā)現(xiàn)新的發(fā)育調(diào)控因子。為了進(jìn)一步研究在根毛細(xì)胞發(fā)育過程中基因的相互作用，Denyer等［17］調(diào)取了單細(xì)胞數(shù)據(jù)中239個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)數(shù)據(jù)，構(gòu)建了精細(xì)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Gene regulatory network，GRN），GRN分 析 結(jié)果顯示了參與根毛發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子以及相互作用關(guān)系，進(jìn)一步將GRN的轉(zhuǎn)錄因子過濾至25個(gè)核心組分，發(fā)現(xiàn)了一系列負(fù)反饋調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。Liu等［20］采用scRNA-seq 技術(shù)解析了擬南芥氣孔譜系細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程中的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)模式，對(duì)氣孔譜系細(xì)胞早期發(fā)育階段中轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示調(diào)控植物幼苗生長、發(fā)育和應(yīng)激響應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子顯著高表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示BPC、WRKY33作為核心轉(zhuǎn)錄因子不僅參與調(diào)控功能基因，還與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用。此外，Jean-Baptiste等［18］對(duì)幼苗進(jìn)行熱脅迫處理，分析了單細(xì)胞水平熱激響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)高溫的熱激基因在不同細(xì)胞類型中都有表達(dá)，但仍有一些基因在不同細(xì)胞類型中存在顯著的差異表達(dá)，植物對(duì)內(nèi)外源信號(hào)的響應(yīng)的細(xì)胞異質(zhì)性應(yīng)該廣泛存在。

4 挑戰(zhàn)與前景

植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究的最大技術(shù)挑戰(zhàn)是將細(xì)胞從適當(dāng)?shù)慕M織中分離出來，并獲得大量的細(xì)胞用于高通量分析。植物細(xì)胞有細(xì)胞壁的保護(hù)，必須先制備成原生質(zhì)體才能制備單細(xì)胞懸液。目前尚未開發(fā)出可以適用于任何植物的通用的制備原生質(zhì)體的方法，這也是植物單細(xì)胞研究樣本單一的原因。因此在制備植物單細(xì)胞懸液過程中，可根據(jù)植物組織的特性，優(yōu)化酶解條件以分離原生質(zhì)體。單細(xì)胞測序產(chǎn)生的背景噪聲數(shù)據(jù)和不同樣本間產(chǎn)生的批次效應(yīng)是處理單細(xì)胞數(shù)據(jù)時(shí)的難點(diǎn)。為此，多種生物信息學(xué)工具已被開發(fā)并成功應(yīng)用于scRNA-seq分析。多篇植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文章證實(shí)了高通量scRNA-seq方法的在植物研究中的可行性和有效性，預(yù)示著植物研究進(jìn)入了單細(xì)胞時(shí)代。未來植物單細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的主要趨勢是提高植物單細(xì)胞分離效率，實(shí)現(xiàn)多樣本多組織研究。近期，有科學(xué)家提出了植物細(xì)胞圖譜計(jì)劃（Plant Cell Altas）［57］，高通量scRNA-seq技術(shù)是其不可或缺的重要一環(huán)。可以預(yù)見單細(xì)胞ChIP-seq、單細(xì)胞ATAC-seq、單細(xì)胞Hi-C等單細(xì)胞測序技術(shù)也會(huì)加入植物單細(xì)胞研究的隊(duì)列，從而使高精度研究單細(xì)胞基因調(diào)控模型成為可能。