新型納米材料與噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

馮林,陳雪嵐

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌,330022)

真菌毒素(mycotoxins)是真菌在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的次級(jí)有毒代謝產(chǎn)物。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),每年全世界范圍內(nèi)大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素的污染,已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生健康問題[1]。截止目前,已發(fā)現(xiàn)400多種化學(xué)結(jié)構(gòu)各異的真菌毒素[2],主要包括黃曲霉毒素 (aflatoxins,AF)、嘔吐毒素 (deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉烯酮 (zearalenone,ZEN)、伏馬毒素 (fumonisin,FB)、赭曲霉毒素A (ocratoxin A,OTA) 等[3]。大多數(shù)真菌毒素可通過抑制動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)和相關(guān)酶的合成,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),損害動(dòng)物體肝臟、腎臟、神經(jīng)、造血、皮膚等組織器官,具有致癌、致畸、致突變、生殖紊亂以及免疫抑制作用[4-7]。真菌毒素分布廣泛、分子量小、結(jié)構(gòu)以及化學(xué)性質(zhì)一般均較穩(wěn)定,即使高溫烹任也無法使其分解[8-9],糧食、飼料以及農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染后,通過食物鏈進(jìn)入人體體內(nèi),嚴(yán)重威脅人類健康。目前，常見的真菌毒素的檢測(cè)方法主要有生物鑒定法、化學(xué)分析法(薄層色譜法)、儀器分析法(高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法)、免疫分析法(酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫法、親和層析法、膠體金免疫層析法)等,以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展及其材料在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用,以及應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選仿真真菌毒素方法的成熟,科研工作者開發(fā)了系列快速、簡(jiǎn)便、綠色、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單的真菌毒素檢測(cè)方法。本文綜述了近年來納米材料及噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用,以期為科研工作者進(jìn)一步研究真菌毒素檢測(cè)方法提供參考。

1 新型納米材料

納米材料通常指三維空間中至少有一維橫向尺寸達(dá)1～100 nm的單質(zhì)、化合物、混合物[10]，具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)、極高的反應(yīng)活性、非凡的電子轉(zhuǎn)移能力和高比表面積等物化特性[11-12],因而具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和尺寸依賴特性,并表現(xiàn)出一系列獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、磁力學(xué)及化學(xué)催化性能[13-14]，被廣泛用作識(shí)別元件的載體和放大檢測(cè)信號(hào)的探針[15-16]。且納米技術(shù)為新型納米比色傳感器的發(fā)展提供了廣闊的空間[17],已成功用于多種真菌毒素的檢測(cè)[18-19]。新型納米材料主要包括金屬納米材料、碳納米材料、磁性納米材料、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒等。

1.1 金屬納米材料

金屬納米材料包括金屬氧化物和貴金屬。貴金屬納米材料是納米材料的一個(gè)重要組成部分,在對(duì)納米材料的研究熱潮中,因其具有傳導(dǎo)性、大的比表面積、局域表面等離子體共振、較高的摩爾消光系數(shù),優(yōu)良的光、電、磁、催化性能以及良好的生物相容性和易于進(jìn)行表面修飾等特點(diǎn)而成為應(yīng)用最為廣泛的納米材料[20]。金屬納米材料在真菌毒素檢測(cè)中主要發(fā)揮4種作用：生物分子的固定化、信號(hào)的產(chǎn)生、熒光猝滅和信號(hào)的放大。URUSOV等[21]用金納米顆粒標(biāo)記AFB1的二抗,采用間接競(jìng)爭(zhēng)法在膠體金免疫層析試紙條上實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的高靈敏檢測(cè),該方法能夠精確地調(diào)整特定抗體和膠體金標(biāo)記所需的數(shù)量,肉眼檢測(cè)限(limit of detection,LOD)為160 pg/mL,儀器檢測(cè)限為30 pg/mL。與純的金屬納米顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)相比,雙金屬?gòu)?fù)合物如Ag@Au、Pt@Au、Cu@Au等極大地提高了檢測(cè)的靈敏度,重現(xiàn)性和穩(wěn)定性也得到了提高。HE等[22]用水熱法合成了直徑約350 nm的Fe3O4納米顆粒,在機(jī)械攪拌下,帶有氨基的親水性聚醚酰亞胺(polyetherimide,PEI)自組裝在Fe3O4納米粒子表面,形成高度分散的Fe3O4@PEI納米粒子。而后制備的帶負(fù)電荷的Au種子通過靜電相互作用均勻附著在帶正電荷的Fe3O4@PEI表面,并在還原劑的作用下,Fe3O4@Au種子成為包覆Au殼的成核位點(diǎn),制備了Fe3O4@Au NFs；再在其上修飾SH-Apt作為捕獲探針,建立了一種用于檢測(cè)花生油中AFB1的超靈敏表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器。由于AFB1適配體及其互補(bǔ)鏈(SH-cDNA)的識(shí)別,報(bào)告探針產(chǎn)生了強(qiáng)烈的表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)信號(hào),而在AFB1存在條件下,AFB1適配體優(yōu)先與AFB1結(jié)合,報(bào)告探針從捕獲探針上釋放,導(dǎo)致SERS強(qiáng)度線性下降,該SERS傳感器的LOD為0.40 pg/mL,在0.000 1～100 ng/mL范圍內(nèi)具有較高的靈敏度。

ZHANG等[23]以鋯離子為節(jié)點(diǎn),鐵卟啉為連接劑成功合成了PCN-223-Fe,并原位負(fù)載PtAg雙金屬納米顆粒,得到了AgPt/PCN-223-Fe復(fù)合材料,由于PCN-223-Fe與AgPt的協(xié)同作用,AgPt/PCN-223-Fe修飾電極對(duì)氧還原具有良好的電催化活性。利用鏈霉親和素(SA)對(duì)AgPt/PCN-223-Fe進(jìn)行功能化得到了SA/AgPt/PCN-223-Fe納米探針,通過生物素和鏈霉親和素的識(shí)別作用,將SA/AgPt/PCN-223-Fe引入電極表面捕獲OTA適配體,產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧還原電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)OTA存在于溶液中時(shí),適配體優(yōu)先與OTA結(jié)合,電化學(xué)信號(hào)降低。所設(shè)計(jì)的OTA 傳感器的LOD為14 fg/mL,檢測(cè)范圍為20～2 ng/mL,成功應(yīng)用于紅酒和玉米樣品中OTA的檢測(cè)。傳統(tǒng)的基于20～30 nm金納米粒子信號(hào)強(qiáng)度不足導(dǎo)致靈敏度較低,只能提供定性或半定量結(jié)果,不能同時(shí)進(jìn)行多次檢測(cè)。此外,用肉眼對(duì)試條上的條帶進(jìn)行視覺觀察很容易出現(xiàn)人為錯(cuò)誤[24]。但金屬納米粒子通過與碳納米材料、磁性納米粒子、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換熒光納米材料等形成復(fù)合材料以及雙金屬納米材料復(fù)合物可顯著提高檢測(cè)靈敏度,實(shí)現(xiàn)高靈敏度定量檢測(cè)真菌毒素。

1.2 碳納米材料

碳納米材料,包括碳納米管(單臂碳納米管和多臂碳納米管)、碳納米纖維、富勒烯、石墨烯量子點(diǎn)和石墨烯等,因其水溶性好、毒性低和可調(diào)的熒光發(fā)射特性而受到廣泛關(guān)注[25]。LIU等[26]采用聚乙烯亞胺功能化的多壁碳納米管對(duì)玻碳電極(glassy carbon electrode,GCE)進(jìn)行修飾,并在其上沉積金和鉑納米顆粒(AuPt-NPs),利用葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)與Fc段結(jié)合的特性將ZEN的單克隆抗體定向固定在電極上,通過測(cè)量抗體抗原免疫復(fù)合物的物理變化所得到的生物傳感器應(yīng)用于ZEN的檢測(cè)。在最優(yōu)條件下,ZEN的線性范圍為0.005～50 ng/mL,LOD為1.5 pg/mL。SHAO等[27]通過將碳量子點(diǎn)封裝在分子印跡聚合物材料中,開發(fā)了一種新型的環(huán)保型熒光猝滅材料作為ZEN傳感器,用于玉米中ZEN的靈敏檢測(cè),檢測(cè)限為0.02 mg/L。LI等[28]制備了石墨烯氧化金納米復(fù)合材料(GO/AuNCs)作為一種新型熒光猝滅平臺(tái),結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增,用于AFB1的超靈敏檢測(cè),LOD為0.03 pg/mL,該方法可以有效地檢測(cè)花生樣品中AFB1的含量。盡管碳納米材料在研究上是切實(shí)可行的,但碳納米材料表面的粘附性仍然有待考究,在日常的應(yīng)用中仍然非常有限。

1.3 磁性納米材料

磁性納米材料是一種同時(shí)具有納米效應(yīng)和磁性能的材料,一般由磁芯和包裹在磁芯上的高分子量聚合物/硅/羥基磷灰石殼層組成,其中包括鐵、鈷或鎳等金屬氧化物。最常見的核心層是由Fe3O4或γ-Fe2O3制成,具有超順磁性或鐵磁性[29]。磁性納米材料由于其表面積大、傳質(zhì)性好、具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)、選擇性吸附能力好、與生物分子的生物相容性好、易于分離、表面修飾和生產(chǎn)等特點(diǎn),近年來人們對(duì)其進(jìn)行了大量的研究。氧化鐵納米粒子被廣泛用于食品分析、蛋白質(zhì)純化和酶固定化中[29],并且Al2O3、Au和Ag可用于修飾磁性納米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)的表面[30]。WANG等[31]以Au@Fe3O4復(fù)合納米材料為模擬酶建立了檢測(cè)谷物和豆類食品中OTA的比色傳感器,LOD可達(dá)到 30 pg/mL。URUSOV等[32]通過共沉淀法制備了MNPs,再和抗體通過物理吸附法形成非共價(jià)復(fù)合物,形成的復(fù)合物與存在于測(cè)試溶液中的抗原結(jié)合,然后用磁場(chǎng)分離抗原,以達(dá)到快速檢測(cè)受污染食品中AFB1的目的,LOD為20 pg/mL,實(shí)現(xiàn)了在有機(jī)萃取劑含量較高的環(huán)境中測(cè)定AFB1。HAO等[33]用金納米粒子(AuNPs)功能化硅包覆氧化鐵磁性納米粒子(mSiO2@Au)和碲化鎘量子點(diǎn)(CdTe QDs)修飾的石墨烯/AuNPs納米復(fù)合材料(GAu/CdTe) 制備了一種超靈敏的OTA電化學(xué)傳感器,線性范圍為0.2～4 pg/mL,LOD為0.07 pg/mL，該方法在食品安全監(jiān)測(cè)和臨床診斷中具有很大的潛力。HENDRICKSON等[34]采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(N1-((ethylimino)methylene)-N3,N3-dimethylpropane-1,3-diamine,EDC)法制備了磁性鐵納米粒子與ZEN的抗體復(fù)合物,在ZEN的存在下,結(jié)合傳統(tǒng)的過氧化物酶標(biāo)記物并催化高靈敏度的化學(xué)發(fā)光底物,實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄酒中ZEN的測(cè)定,LOD為0.06 ng/mL。但磁性納米材料與其他納米材料相比,更易氧化和團(tuán)聚,導(dǎo)致吸附量大大降低。

1.4 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)(guantum dots,QDs)作為半導(dǎo)體納米晶體,一般是由Zn、Cd和Te、Se組成的化合物,表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)和電子性質(zhì),如高量子產(chǎn)率、高摩爾消光系數(shù)、高耐光漂白、寬吸收光譜、窄而對(duì)稱的發(fā)射帶、大小可調(diào)、化學(xué)降解等優(yōu)良性能,在分析化學(xué)領(lǐng)域極具吸引力[3,35-36]；并且量子點(diǎn)由于其物理特性而成為理想的顯像劑,還為基因分析、診斷和藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的工具[37]，并在許多情況下,它們通常結(jié)合高特異性的生物分子,如抗體和適配體,而不影響其發(fā)射特性或適配體/抗體特異性。DUAN等[38]通過微乳液法合成了量子點(diǎn)微球,將激發(fā)在575和615 nm的CdSe/ZnS QDs包裹在量子點(diǎn)微球中,合成了具有黃色、橙色和紅色發(fā)光特性的3種量子點(diǎn)熒光微球,將之分別與抗ZEN、OTA、FB1的單克隆抗體偶聯(lián),在10 min內(nèi)對(duì)ZEN、OTA、FB1的LOD分別達(dá)到10、5、20 ng/mL,實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米樣品中ZEN、OTA和FB1這3種真菌毒素的定性聯(lián)檢。GUO等[39]將分子印跡技術(shù)與量子點(diǎn)技術(shù)相結(jié)合,合成了基于MIP@CdTe QDs的新型熒光傳感器,用于對(duì)AFB1的快速特異性識(shí)別,LOD達(dá)到4 ng/g。該方法成功地應(yīng)用于實(shí)際樣品中AFB1的定量測(cè)定。ZHANG等[40]用氨基功能化的核/多殼量子點(diǎn)(QDs)和抗DON的單克隆抗體偶聯(lián)物作為熒光檢測(cè)探針,建立了一種靈敏可靠的直接競(jìng)爭(zhēng)熒光標(biāo)記免疫吸附法,在優(yōu)化條件下,LOD為12.2 μg/kg,實(shí)現(xiàn)了在玉米樣品中DON的快速、靈敏、高效檢測(cè)。但量子點(diǎn)目前沒有比較完善的合成技術(shù),種類不多,與生物大分子結(jié)合會(huì)存在非特異性吸附,其穩(wěn)定性、生物毒性和性能還有待于研究與開發(fā)。

1.5 上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒

上轉(zhuǎn)換納米粒子(up-conversion nanoparticles,UCNPs)是一種新型的發(fā)光材料,能將低能量的近紅外輻射轉(zhuǎn)化為高能量的可見輻射。其以低背景噪聲、高光穩(wěn)定性、低毒性、對(duì)組織的信號(hào)穿透能力強(qiáng)、吸收能力弱等特點(diǎn),受到了各領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[41]。WU等[42]采用戊二醛法制備了人工抗原修飾的氨基化Fe3O4磁性納米顆粒和抗體功能化上轉(zhuǎn)化納米顆粒作為信號(hào)探針,建立了一種新型的、靈敏的聯(lián)檢食品樣品中AFB1和OTA的免疫分析方法,競(jìng)爭(zhēng)模式下AFB1和OTA在最佳條件下的LOD均為0.01 ng/mL,線性范圍為0.01～10 ng/mL，該方法已成功應(yīng)用于測(cè)定天然污染玉米樣品中的AFB1和OTA。SUN等[43]用單克隆抗體修飾NaYF4∶Yb,Er(NaYF)納米顆粒,其中NaYF4作為基質(zhì)材料,Yb3+作為敏化劑,Er3+作為激活劑,制備了熒光探針,用抗原修飾磁性納米粒子制成免疫傳感探針,對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè),線性范圍為0.2～100 ng/mL,LOD為0.2 ng/mL,該方法可用于花生油或其他谷物中真菌毒素的快速篩查。張瑩瑩等[44]制備了水溶性的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料,并在其表面修飾了OTA適配體作為能量供體探針,在金納米粒子表面修飾了OTA適配體互補(bǔ)鏈作為能量受體探針,建立了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的傳感方法檢測(cè)OTA,其線性范圍為0.001～10 ng/mL,檢出限為0.001 ng/mL,且顯示能特異性地檢測(cè)實(shí)際樣品啤酒中的OTA。但想要得到尺寸和形貌可控、發(fā)光性能好的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的有效合成方法和表面修飾功能化方法不多,且發(fā)光效率在很大程度上取決于上轉(zhuǎn)換的基質(zhì)材料,限制了其在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。

此外,金屬有機(jī)骨架(metal orgaic framework,MOF)和共價(jià)有機(jī)框架(covalentorganic framework,COF)因其獨(dú)特的性質(zhì)在真菌毒素中也得到了廣泛的應(yīng)用。BAGHER等[45]通過在片狀MOF的納米孔內(nèi)制備銀納米粒子(AgNPs),合成了AgNPs@ZnMOF復(fù)合材料,以展青霉素為模板,通過3-氨基丙基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯單體的共聚合,在AgNPs@ZnMOF表面形成分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)層,利用MIP的選擇性識(shí)別特征和新型AgNPs@ZnMOF納米復(fù)合材料優(yōu)異的過氧化物活性,以及靈敏的熒光檢測(cè)系統(tǒng),設(shè)計(jì)了一種可靠的展青霉素探針,并成功用于展青霉素的選擇性測(cè)定。其線性范圍為0.1～10 μmol/L,LOD為0.06 μmol/L。該方法能夠選擇性地在復(fù)雜介質(zhì)中測(cè)量展青霉素,不受類似物的干擾。Gu等[46]首次研制了基于金納米粒子(AuNPs)摻雜分子印跡層和共價(jià)有機(jī)骨架復(fù)合物(COFs-AuNPs)的石英晶體微平衡傳感器用于檢測(cè)AFB1,其線性范圍為0.05～75 ng/mL,LOD為2.8 pg/mL。目前,MOFs的水穩(wěn)定性差,結(jié)構(gòu)在溶液中容易坍塌,選擇性有限,因此有研究者結(jié)合MOFs和COFs的優(yōu)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的包封,大大提高酶的裝載率以及酶活性[47]。

2 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是20世紀(jì)80年代逐步建立并發(fā)展起來的一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)可以構(gòu)建抗體庫、隨機(jī)肽庫、蛋白質(zhì)突變體庫和cDNA文庫等，不僅廣泛用于單鏈抗體的篩選、人源單克隆抗體的制備、先導(dǎo)化合物的篩選、藥物篩選、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、疫苗的研制、制藥、免疫學(xué)、蛋白質(zhì)工程、醫(yī)學(xué)診斷、抗腫瘤[48]等研究領(lǐng)域,還已成為尋找高親和力生物活性配體分子、探索受體與配體之間的相互作用位點(diǎn)、檢測(cè)未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位的工具[49]。目前,用于構(gòu)建展示文庫的噬菌體主要有絲狀噬菌體、λ噬菌體、T4噬菌體和T7噬菌體。單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)為pⅢ、pⅧ展示系統(tǒng)及其他展示系統(tǒng)；λ噬菌體展示系統(tǒng)中g(shù)pD可作為外源序列融合的載體,這種展示一般為N端展示；T4噬菌體展示系統(tǒng)為SOC位點(diǎn)的C末端和HOC位點(diǎn)的N末端；T7噬菌體展示系統(tǒng)是通過C端融合表達(dá)蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌體載體基因10的C端,各系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1 噬菌體展示技術(shù)篩選的模擬表位在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

噬菌體展示技術(shù)是一種快速、經(jīng)濟(jì)、有效的新型分子探針技術(shù),它可以從一個(gè)巨大的隨機(jī)文庫中篩選特定的配體,并產(chǎn)生獨(dú)特的多肽、蛋白和抗體,這些蛋白和抗體能夠高親和力和高特異性地與目標(biāo)結(jié)合。何慶華等[50]以抗ZEN單克隆抗體為配體,利用噬菌體七肽庫經(jīng)3輪淘選后成功淘選到ZEN的模擬表位,其氨基酸序列分別為DAVILLM及HHCHWWH,ELISA顯示2種序列均為陽性克隆,對(duì)ZEN毒素的抑制率達(dá)90%以上,檢測(cè)線性范圍為0.1～10 mg/L。HE等[51]以O(shè)TA為模型系統(tǒng),通過二代肽文庫篩選,分離得到1株十二肽型寡聚體,建立了OTA的化學(xué)發(fā)光ELISA檢測(cè)方法,線性范圍為0.006～0.245 ng/mL,并將其用于試紙條中,肉眼可視截止水平為1 ng/mL。ZOU等[52]利用商品化的7肽肽庫經(jīng)過4輪生物鑒定完成后,鑒定出30個(gè)克隆為陽性噬菌體顆粒,這些噬菌體的顆粒DNA測(cè)序結(jié)果顯示了6種不同的肽序列,其中肽序列為GMVQTIF的噬菌體顆粒對(duì)OTA檢測(cè)的敏感性最高。因此設(shè)計(jì)了生物素化的12聚體肽GMVQTIF-GGGSK-biotin作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原,建立競(jìng)爭(zhēng)性肽ELISA。LOD為0.001 ng/mL,線性范圍為0.005～0.2 ng/mL,其作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原的效率大約是OTA-HRP偶聯(lián)物的5倍。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)表明,生物素化12聚體肽對(duì)抗OTA單克隆抗體的親和力低于常規(guī)化學(xué)OTA抗原。該方法可用于食品安全監(jiān)測(cè)中其他有毒小分子的敏感檢測(cè)。

2.2 噬菌體展示技術(shù)篩選的重組抗體在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

目前,利用噬菌體展示技術(shù)制備抗真菌毒素單鏈抗體的真菌毒素有玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、橘霉素等。噬菌體顯示抗體片段制備簡(jiǎn)單、毒性低,包括重鏈可變區(qū)域(VHH)、單鏈可變片段(scFv)和抗原結(jié)合片段(Fab),VHH具有毒性低、溶解度高、易于遺傳編輯、產(chǎn)量高、重折疊能力強(qiáng)等特點(diǎn),與Fab和scFv相比,Fab和scFv更容易聚集,對(duì)目標(biāo)親和力較低,具有相當(dāng)或更高的敏感性和親和力,且具有優(yōu)越的物理化學(xué)穩(wěn)定性[53]。HE等[54]構(gòu)建了篩選AFB1抗體(Nb)的噬菌體展示文庫,選擇了2種AFB1特異性納米體Nb26和Nb28進(jìn)行ELISA,線性范圍分別為0.117～5.676和0.171～6.431 μg/kg。WANG等[53]以羊駝VHH噬菌體展示文庫中的抗ZEN單克隆抗體(mAb)作為模板,經(jīng)過4輪循環(huán)篩選,分離得到1個(gè)與抗ZEN單克隆抗體高度親和的抗獨(dú)特型抗體VHH噬菌體Z1。基于Z1的ZEN噬菌體ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,線性范圍為0.11～0.55 ng/mL,LOD為0.08 ng/mL。此外,將Z1的噬菌體顆粒應(yīng)用于免疫聚合酶鏈反應(yīng)(immuno-polymerase chain reaction,PD-IPCR)中,提供了檢測(cè)抗原和DNA模板。與噬菌體ELISA相比,Z1在PD-IPCR的基礎(chǔ)上LOD提高了12倍,LOD為6.5 pg/mL,線性范圍為0.01～100 ng/mL。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜驗(yàn)證了該方法的有效性,結(jié)果表明,PD-IPCR法用于谷物樣品中ZEN的測(cè)定是可靠的,利用抗獨(dú)特型VHH噬菌體作為無毒代物和PCR的信號(hào)擴(kuò)增功能,使其在實(shí)際谷物ZEN分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。SOMPUNGA等[55]報(bào)道了利用噬菌體展示抗體技術(shù)篩選到1株對(duì)游離 ZEN具有特異性的scFv克隆yZEN2A8,將編碼yZEN2A8 scFv的基因亞克隆到pET-21 d(+)和pKP300 III載體中,分別生成重組scFv和scFv-Ap抗體,在優(yōu)化條件下,競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,重組yZEN2A8 scFv抗體和scFv-Ap融合抗體的IC50分別為90 ng/mL和14 ng/mL,LOD分別為20 ng/mL和2 ng/mL。同源模型顯示了重組抗體與ZEN的特異性結(jié)合,并證明了在抗體-抗原相互作用中,可變重鏈和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)的作用。

3 新型納米材料結(jié)合噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來,噬菌體展示技術(shù)與納米技術(shù)的結(jié)合在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展,如醫(yī)學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)、分子成像、靶向藥物和基因傳遞、疫苗開發(fā)以及骨和組織修復(fù)等技術(shù)。噬菌體這種感染細(xì)菌的病毒是進(jìn)行納米操作的理想材料,利用DNA合成、定點(diǎn)誘變和分子克隆等方法,可以很容易地對(duì)其進(jìn)行工程設(shè)計(jì),并將其作為制造納米材料的多功能支架。Ngo-Duc等[56]利用噬菌體與氯仿的反復(fù)混合使900 nm的絲狀噬菌體濃縮成為直徑60 nm的球狀,轉(zhuǎn)化后的病毒保留了金的結(jié)合和礦化特性,用于組裝金膠體團(tuán)簇和合成金納米結(jié)構(gòu)。YI等[57]展示了基因工程的多功能M13噬菌體的p8主要外殼蛋白用來組裝熒光單壁碳納米管,p3次要外殼蛋白用于前列腺腫瘤的靶向熒光成像。NGUYEN等[58]利用噬菌體展示技術(shù)在pVIII衣殼蛋白上顯示了富含半胱氨酸的多肽,其作為硫醇供體被還原生成活性硫醇基團(tuán),并與金包覆磁性納米粒子高度凝聚結(jié)合,形成磁性噬菌體模板；再將特異性抗體和拉曼染料生物偶聯(lián)在納米顆粒表面制備成SERS基底,通過抗體和抗原的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)膿毒癥的檢測(cè)。HUANG等[59]將M13病毒作為一種多功能的生物支架,在其病毒衣殼上以分子精度裝配熒光團(tuán),開發(fā)了M13病毒、花青素3染料和銀納米顆粒的聯(lián)合裝配；通過調(diào)節(jié)納米顆粒大小以及納米粒子與染料之間的距離,實(shí)現(xiàn)了高達(dá)24倍的花青素3的增強(qiáng)發(fā)射；且熒光隨著病毒衣殼上染料表面密度的增加而增強(qiáng),從而創(chuàng)建了一種能夠精確結(jié)合分子并具有高發(fā)射率的熒光探針。GUO等[60]利用噬菌體的抗體片段的克隆化和表達(dá)系統(tǒng)成功篩選到能夠特異性識(shí)別炭疽芽孢桿菌的單克隆抗體8G3,將其插入到噬菌體M13KO7的gp3蛋白基因上；gp8蛋白基因上插入金結(jié)合肽序列VSGSSPDS；得到的噬菌體顆粒同時(shí)在噬菌體末端展示抗體及多個(gè)結(jié)合金肽拷貝,構(gòu)建了一個(gè)雙功能噬菌體；將銀增強(qiáng)技術(shù)應(yīng)用于噬菌體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)信號(hào),結(jié)果顯示炭疽芽孢桿菌靈敏度為5×103CFU,比傳統(tǒng)的噬菌體免疫試驗(yàn)提高10倍。目前,納米材料與噬菌體展示技術(shù)在食品中的應(yīng)用主要集中在食源性致病菌、病原菌檢測(cè)等方面,在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用還較少報(bào)道。

4 結(jié)論與展望

綜上所述,納米材料可以通過疏水作用、氫鍵作用、靜電作用、共價(jià)作用和π-π堆疊作用等有效地捕獲真菌毒素。雖然各種納米材料都各有其優(yōu)缺點(diǎn),但不同種類的納米材料組合起來能明顯提高真菌毒素的檢測(cè)靈敏度。利用噬菌體展示技術(shù)淘選真菌毒素模擬表位肽,用這些模擬表位肽替代檢測(cè)中的毒素標(biāo)品,降低抗體制備成本,減輕對(duì)操作人員和環(huán)境的危害,最重要的是噬菌體還可作為納米材料的支架,制備多種檢測(cè)探針,檢測(cè)食源性致病菌、病原菌。雖然納米材料與噬菌體展示技術(shù)分別在真菌毒素檢測(cè)中都有很廣泛的應(yīng)用,但其結(jié)合技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)方面還處于實(shí)驗(yàn)室階段,然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果已昭示新型納米材料與噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合無疑會(huì)引導(dǎo)未來對(duì)真菌毒素綠色、經(jīng)濟(jì)、高靈敏檢測(cè)的潮流。