三種澤瀉提取物的抗氧化活性及23-乙酰澤瀉醇B含量的研究

畢麗偉，龐海月，陳煜沛,，黃立森,，吳黌坦,，張亞楠，王貴弘,*

(1.廈門醫(yī)學院藥學系，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院公共衛(wèi)生與醫(yī)學技術(shù)系，福建 廈門 361023；3.天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；4.廈門市中藥生物工程重點實驗室，福建 廈門 361023)

澤瀉(AlismaplantagoaquaticaLinn.)是喜溫耐濕的多年生沼生植物，干燥塊莖入藥，主治熱淋澀痛、疲飲眩暈、水腫脹滿、小便不利和遺精等癥，收錄于《中華人民共和國藥典》2015年版中[1]。澤瀉的主要化學成分為三萜類、二萜類、倍半萜類，還含有氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、脂肪酸、糖類、植物甾醇等少量化學成分[2-5]。研究表明，澤瀉具有利尿、抗腎結(jié)石、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、抗脂肪肝等多種生物活性[6-7]；另有報道，澤瀉具有較強的毒性，尤其是腎毒性[8]。《中華人民共和國藥典》2015年版將23-乙酰澤瀉醇B(圖1)作為澤瀉藥材的標準物質(zhì)[7,8-11]。作者采用總抗氧化能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力評價澤瀉水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物的抗氧化活性，并采用HPLC法分析3種提取物中主成分23-乙酰澤瀉醇B的含量差異，擬為澤瀉的開發(fā)利用提供幫助。

圖1 23-乙酰澤瀉醇B的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of 23-acetyl alisol B

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

澤瀉(福建產(chǎn))飲片，北京同仁堂有限責任公司。

乙醇、乙腈(色譜級)，西隴化工股份有限公司；23-乙酰澤瀉醇B標準品，成都瑞芬思生物科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒、羥基自由基清除能力檢測試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津；R-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Panchum公司；Sunrise型多功能酶標儀，Tecan公司；LE2002E型電子天平，Mettler Toledo公司；冷凍干燥機，Labconco公司。

1.2 澤瀉提取物的制備

將澤瀉飲片干燥，稱取適量按料液比1∶10 (g∶mL)分別加入水、65%乙醇、95%乙醇加熱回流萃取1 h，過濾，得到第1次濾液；濾渣再經(jīng)上述步驟重復萃取2次，得到第2、3次濾液；合并3次濾液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后[9]，分別得到澤瀉水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物。

1.3 澤瀉提取物的抗氧化活性評價

1.3.1 總抗氧化能力的測定(FRAP法)

FRAP工作液的配制：取TPTZ稀釋液1 500 μL、TPTZ溶液150 μL混合均勻，加入檢測緩沖液150 μL，即得FRAP工作液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，備用。

標準曲線的繪制：稱取27.8 mg FeSO4·7H2O，溶解并定容至1 mL，得到濃度為100 mmol·L-1的FeSO4標準溶液，分別稀釋得到濃度為0.15 mmol·L-1、0.30 mmol·L-1、0.60 mmol·L-1、0.90 mmol·L-1、1.20 mmol·L-1、1.50 mmol·L-1的FeSO4標準溶液。向96孔板的每個檢測孔加入FRAP工作液180 μL，樣品檢測孔加入5 μL不同濃度(1.25 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1)的樣品溶液，標準曲線檢測孔加入5 μL不同濃度的FeSO4標準溶液，空白對照孔加入蒸餾水，陽性對照孔加入Trolox(0.15 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1、1.2 mmol·L-1、1.5 mmol·L-1)；混合均勻，反應3～5 min后，測定593 nm處吸光度，繪制標準曲線，按式(1)計算總抗氧化能力(U·g-1)：

(1)

式中：x為溶液中Fe2+-TPTZ含量，μmol·mL-1；V總為反應總體積，1.02 mL;V樣為反應液中樣品體積，0.03 mL；c樣為樣品濃度，mg·mL-1。

1.3.2 羥基自由基清除率的測定(氧化鄰二氮菲-Fe2+法)

按照羥基自由基清除能力檢測試劑盒說明書，將試劑一0.15 mL、試劑二0.4 mL和試劑三0.1 mL混合均勻，檢測管加入不同濃度(1.25 mg· mL-1、2.5 mg· mL-1、5.0 mg· mL-1)的樣品溶液0.25 mL和試劑四0.1 mL，對照管加入蒸餾水0.25 mL和試劑四0.1 mL，空白管加入0.35 mL蒸餾水，混合均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min，10 000 r·min-1離心10 min，測定536 nm處吸光度，按式(2)計算羥基自由基清除率：

(2)

式中：A測、A對和A空分別為檢測管、對照管和空白管的吸光度。

1.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測定

按照超氧陰離子自由基清除能力檢測試劑盒說明書，檢測管和對照管加入試劑一40 μL、試劑二160 μL，空白管加入試劑一40 μL、蒸餾水160 μL，充分混勻，25 ℃水浴反應1 min；檢測管加入不同濃度的樣品溶液100 μL，空白管和對照管加入蒸餾水100 μL，各管均加入試劑三200 μL，混合均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應30 min；各管均加入試劑四和試劑五各200 μL，混合均勻，37 ℃顯色20 min，測定530 nm處吸光度，按式(3)計算超氧陰離子自由基清除率：

(3)

式中：A測、A對分別為檢測管、對照管的吸光度。

1.4 23-乙酰澤瀉醇B含量的測定[10-12]

采用HPLC法測定23-乙酰澤瀉醇B含量。色譜條件：Waters T3色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動相乙腈-水(1‰甲酸)(27∶73，體積比)，檢測波長208 nm，流速1.0 mL·min-1，進樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 澤瀉提取物的抗氧化活性評價

2.1.1 總抗氧化能力

對標準曲線進行擬合，得線性回歸方程為A=10.18c+0.0061，R2=0.9980。經(jīng)計算，澤瀉水提取物、65%乙醇提取物、95%乙醇提取物的總抗氧化能力分別為0.305 U·g-1、0.313 U·g-1、0.208 U·g-1，即澤瀉65%乙醇提取物的總抗氧化能力最高，澤瀉水提取物次之，澤瀉95%乙醇提取物最低。

2.1.2 羥基自由基清除能力(圖2)

從圖2可以看出，澤瀉不同溶劑提取物對羥基自由基均有一定的清除能力。當濃度為1.25～5.00 mg·mL-1時，澤瀉各提取物對羥基自由基的清除率隨濃度的增加逐漸升高。當濃度為5.0 mg·mL-1時，澤瀉水提取物、65%乙醇提取物、95%乙醇提取物對羥基自由基的清除率分別為46.03%、54.00%、21.13%。

圖2 澤瀉提取物對羥基自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of extracts of Alisma plantagoaquatica Linn.to hydroxyl free radical

2.1.3 超氧陰離子自由基清除能力(圖3)

圖3 澤瀉提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of extracts of Alisma plantagoaquatica Linn.to superoxide anion free radical

從圖3可以看出，3種提取物對超氧陰離子自由基的清除能力較弱，當濃度為5.0 mg·mL-1時，澤瀉水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物對超氧陰離子自由基的清除率分別為15.87%、12.90%、31.87%。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線及線性范圍

精密稱取23-乙酰澤瀉醇B標準品適量，用乙腈分別配制濃度為5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1的23-乙酰澤瀉醇B標準溶液，按1.4色譜條件進樣測定。以峰面積(y)為縱坐標、23-乙酰澤瀉醇B濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為：y=16029c-13583，R2=0.9999。表明，23-乙酰澤瀉醇B濃度在5～80 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度

取23-乙酰澤瀉醇B標準溶液，按1.4色譜條件連續(xù)進樣6次，測得峰面積的RSD為1.54%。表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性

取23-乙酰澤瀉醇B標準溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h按1.4色譜條件進樣測定，測得峰面積的RSD為0.36%。表明23-乙酰澤瀉醇B標準溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 澤瀉各提取物中23-乙酰澤瀉醇B含量的比較

HPLC法測定結(jié)果表明，澤瀉水提取物中不含23-乙酰澤瀉醇B，澤瀉65%乙醇提取物和 95%乙醇提取物中23-乙酰澤瀉醇B含量分別為 0.632%和0.598%，兩者含量相近。表明，23-乙酰澤瀉醇B集中在澤瀉的乙醇提取物中。

3 結(jié)論

澤瀉水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物均具有一定的抗氧化活性，但對超氧陰離子自由基的清除能力較弱。澤瀉水提取物不含23-乙酰澤瀉醇B，澤瀉65%乙醇提取物和95%乙醇提取物中23-乙酰澤瀉醇B的含量相近，但這兩種提取物在抗氧化活性方面具有一定差異，可推斷澤瀉的乙醇提取物中依然有其它物質(zhì)，需要進一步分析，為澤瀉的化學成分分析提供了新思路。