博落回根莖葉揮發(fā)油化學(xué)成分及抗菌活性研究

李春梅，劉 爽，邢 丹，劉冰梅，季宇彬*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150070;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物研究所博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150070；3.濟寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)信息工程學(xué)院，山東 日照 276826;4.黑龍江省醫(yī)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001)

揮發(fā)油又稱芳香油或精油，是植物經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)性油狀液體，主要由萜和芳香族化合物及其含氧衍生物組成，少數(shù)為脂肪族化合物和雜原子化合物[1]。揮發(fā)油是植物的一種次生代謝產(chǎn)物，因其化學(xué)組成的特殊性，具有較好的抗氧化、抗菌和殺蟲等生物活性，是新型低毒的抗氧化劑、殺菌防腐劑和天然香料的重要來源。揮發(fā)油在植物界中分布廣泛，其存在部位由于品種不同而表現(xiàn)不同，在植物根、莖、葉、花以及果實的某些器官中具有較高的含量。由于地理位置、環(huán)境、農(nóng)藝條件或者晝夜節(jié)律的不同，同種植物的揮發(fā)油成分也表現(xiàn)出差異。我國具有豐富的植物資源，為揮發(fā)油的研究開發(fā)以及利用提供了很好的條件[2]。提取植物揮發(fā)油采用水蒸氣蒸餾法[3]，測定植物揮發(fā)油主要采用氣相色譜法[4]、高效液相色譜法、紫外分光光度法[5]以及近紅外光譜法[6]等。

博落回[Macleayacortada(Willd) R.Br.]是罌粟科多年生的高大的草本類植物[7]，在我國分布廣泛，因產(chǎn)地不同，而有不同的別名約20 多種。博落回的主要生物活性成分是異喹啉類生物堿[8]，可用來治療人、畜多種感染性疾病，具有抗菌[9]、消炎[10]、清熱解毒、增強免疫力、抗腫瘤[11]等多種作用。關(guān)于博落回的研究主要集中在生物堿成分的提取分離、含量測定以及藥理活性方面[12]，而對于博落回?fù)]發(fā)油的藥理活性的研究[13]較少。鑒于此，作者采用水蒸氣蒸餾法對博落回根、莖、葉等3個部位的揮發(fā)油進行提取，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[14]對其進行化學(xué)成分分析，并初步評價其抗菌活性，擬為博落回資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

博落回鮮草，于 2018 年 10 月初采于貴州銅仁地區(qū)，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院金哲雄教授鑒定為罌粟科博落回屬植物博落回(Macleayacortada(Willd)R.Br.)，儲存于哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室，標(biāo)本號為20181046。將博落回鮮草的根、莖、葉、果實分開，自然陰干后，粉碎過 40 目篩，于 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹15]。

氯化鈉，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙醇，天津天力化學(xué)試劑有限公司；正己烷，天津富宇精細(xì)化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、碳酸鈉、無水硫酸鈉、乙醚等試劑均為分析純；超純水。

HP6890/5975C 型GC/MS聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州恒久儀器制造有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司； FA2204B型電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；JP-040ST型潔盟牌超聲波清洗機，深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司。

1.2 供試菌株

革蘭氏陽性菌：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ATCC 6633、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 27217、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus) ATCC 29213；革蘭氏陰性菌：青枯病菌(Pseudomonassolanacearum) GMI 1000、農(nóng)桿菌(Agrobacterium) ATCC 11158、大腸桿菌(Escherichiacoli) CMCC 44102；真菌：黑曲霉(Aspergillusniger) CMCC 98003；酵母菌:白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC 10231。

1.3 博落回根、莖、葉揮發(fā)油的提取[13]

分別稱取適量博落回根、莖、葉粉末置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水浸泡過夜，揮發(fā)油測定器中加入一定量的正己烷，電熱套連續(xù)加熱，水蒸氣蒸餾至揮發(fā)油測定器中油量不再增加，停止加熱，靜置片刻，將水緩緩放出，收集正己烷層，常溫?fù)]去部分溶劑，得到油相部分。水相部分加氯化鈉至飽和后，用無水乙醚萃取3次。將合并后的油相和乙醚萃取液用無水硫酸鈉脫水過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，即得具有特殊香味的淡黃色博落回?fù)]發(fā)油，根、莖、葉揮發(fā)油得率分別為0.0476%、0.0575%、0.0703%，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 GC-MS 分析條件[13]

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI-5%phenyl-95%dimethylpolysiloxane彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫50 ℃(保持2 min)，以5 ℃·min-1升溫至310 ℃(保持8 min)；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓52.5 kPa；載氣流量1.0 mL·min-1；分流比40∶1；溶劑延遲時間5.0 min。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 624 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～480 amu。

1.5 抗菌活性評價

1.5.1 菌株的培養(yǎng)

采用3株革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌ATCC 6633、金黃色葡萄球菌ATCC 27217和溶血性葡萄球菌ATCC 29213)、3株革蘭氏陰性菌(青枯病菌GMI 1000、農(nóng)桿菌ATCC 11158、大腸桿菌CMCC 44102)、1株真菌(黑曲霉CMCC 98003)和1株酵母菌(白色念珠菌ATCC 10231)進行抗菌活性測定。細(xì)菌菌株在LB培養(yǎng)基(酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH值 7) 中于37 ℃培養(yǎng)24 h；真菌和酵母菌在馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)48 h。供試菌懸液稀釋至106CFU·mL-1后用于檢測。

1.5.2 圓盤擴散實驗

博落回葉揮發(fā)油抗菌活性的測定采用標(biāo)準(zhǔn)圓盤擴散法。揮發(fā)油以10 mg·mL-1的初始濃度溶解于DMSO中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后滅菌。向無菌試紙(直徑6 mm)注射10 mg·mL-1的揮發(fā)油溶液10 μL，置于平板上，細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)72 h，真菌和酵母菌于27 ℃培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈直徑。使用1個空盤來測試盤是否無菌，以DMSO為陰性對照，慶大霉素(20 g/盤)為細(xì)菌陽性對照，制霉菌素(20 g/盤)為真菌和酵母菌陽性對照。

1.5.3 最小抑制濃度(MIC)的測定

采用連續(xù)肉湯稀釋法測定MIC。采用連續(xù)二倍稀釋法制備1 000～7.8 g·mL-1的揮發(fā)油溶液，加入到含有1 mL培養(yǎng)基的試管中，再分別加入20 mL供試菌懸浮液(106CFU·mL-1)。細(xì)菌、真菌和酵母菌于37 ℃培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 博落回根、莖、葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量

按GC-MS分析條件，對博落回根、莖、葉揮發(fā)油進行檢測，得到博落回根、莖、葉揮發(fā)油的總離子流色譜圖，見圖1。

圖1 博落回根(a)、莖(b)、葉(c)揮發(fā)油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion spectra of volatile oil from roots(a),stems(b),and leaves(c) of Macleaya cortada

對總離子流色譜圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對NIST2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，并對檢索結(jié)果進行人工解析及查對文獻。采用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的含量，結(jié)果見表1。

由表1可知，從博落回根揮發(fā)油中共鑒定出52種成分，占揮發(fā)油總含量的91.673%。其中含量較高的前10種成分依次是：棕櫚酸(21.033%)、肉豆蔻酸(8.917%)、鄰苯二甲酸丁酯(8.191%)、月桂酸(5.842%)、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚(4.874%)、鄰苯二甲酸二異辛酯(3.283%)、亞油酸(3.203%)、鄰苯二甲酸異丁酯(2.886%)、正十五碳醛(1.884%)、二十八烷(1.874%)。

表1 博落回根、莖、葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量

續(xù)表1

續(xù)表1

從博落回莖揮發(fā)油中共鑒定出50種成分，占揮發(fā)油總含量的99.159%。其中含量較高的前10種成分依次是：棕櫚酸(37.516%)、正十五碳醛(8.741%)、鄰苯二甲酸丁酯(7.426%)、亞油酸(5.889%)、(E)-9，17-十八碳二烯醛(3.631%)、十九烷(3.568%)、肉豆蔻酸(3.509%)、鄰苯二甲酸二異辛酯(3.424%)、鄰苯二甲酸異丁酯(2.127%)、十五酸(1.941%)。

從博落回葉揮發(fā)油中共鑒定出68種成分，占揮發(fā)油總含量的92.549%。其中含量較高的前10種成分依次是：十六醛(20.628%)、葉綠醇(18.508%)、(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯醛(13.510%)、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚(8.723%)、棕櫚酸(4.334%)、β-紫羅蘭酮(2.962%)、二氫食用西番(2.725%)、6,10,14-trimethyl-pentadecanone(2.031%)、正十四碳烷(1.889%)、鄰苯二甲酸異丁酯(1.819%)。

博落回的根、莖揮發(fā)油中含量最高的成分均為棕櫚酸，根、莖揮發(fā)油成分種類比較接近，但葉揮發(fā)油成分與根、莖明顯不同，不同部位揮發(fā)油含量差異極大。從博落回根、莖、葉等3個部位的揮發(fā)油中共鑒定出96種化學(xué)成分，僅有24種成分是3個部位共有的，根、莖揮發(fā)油共有成分有41種，根、葉揮發(fā)油共有成分有30種，莖、葉揮發(fā)油共有成分有28種。根、莖、葉揮發(fā)油特有成分分別有6種、5種、35種。

2.2 博落回葉揮發(fā)油的抗菌活性(表2)

由表2可知，供試菌的抑菌圈直徑為(7.7±0.6)～(15.9±0.8) mm，MIC值為125～500 μg·mL-1。其中青枯病菌GMI 1000和金黃色葡萄球菌ATCC 27217對博落回葉揮發(fā)油的敏感性較高，其抑菌圈直徑分別為(15.9±0.8) mm和(15.1±1.0) mm，MIC值均為125 μg·mL-1。博落回葉揮發(fā)油對真菌和酵母菌也有抗菌活性，對細(xì)菌和真菌的抗菌活性呈劑量依賴性。博落回葉揮發(fā)油對供試菌的抑菌圈直徑與MIC值呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。對照治療(DMSO)沒有顯示出抗菌活性。

表2 博落回葉揮發(fā)油的抗菌活性

2.3 討論

采用水蒸氣蒸餾法提取博落回?fù)]發(fā)油，利用GC-MS法共鑒定出96種成分，可見博落回?fù)]發(fā)油的化學(xué)成分比較復(fù)雜。博落回根、莖、葉等3個部位的揮發(fā)油成分存在極大差異，96種成分中，3個部位的共有成分只有24種，根、莖揮發(fā)油共有成分有41種，根、葉揮發(fā)油共有成分有30種，莖、葉揮發(fā)油共有成分有28種。根揮發(fā)油特有成分有6種，莖揮發(fā)油特有成分有5種，葉揮發(fā)油特有成分有35種。博落回葉揮發(fā)油的抑菌圈直徑為(7.7±0.6)～(15.9±0.8) mm，MIC值為125～500 μg·mL-1，說明博落回葉揮發(fā)油具有一定的抗菌活性。博落回?fù)]發(fā)油中含有豐富的香料、藥用等化學(xué)成分，具有重要的開發(fā)利用價值。其中博落回葉揮發(fā)油的主要成分十六醛(棕櫚醛)(20.628%)主要用于調(diào)制化妝品香精，以及杏、桃、莓等果香型香精；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯醛(13.510%)是美國白蛾性信息素中兩個主要成分之一，應(yīng)用于預(yù)報、監(jiān)測和防治美國白蛾等方面，并且已經(jīng)獲得了較好的效果；β-紫羅蘭酮(2.962%)是一種極其重要的香料，用于皂用香精，也是合成維生素A的原料，常用于烘烤食品、冰凍乳制品、布丁。根、莖揮發(fā)油中的棕櫚酸(21.033%、37.516%)有較強的抗腫瘤作用，能引起人成骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡[16]。

3 結(jié)論

通過對博落回?fù)]發(fā)油化學(xué)成分及抗菌活性的初探，發(fā)現(xiàn)博落回?fù)]發(fā)油含有多種芳香族和不飽和脂肪酸、醛、酮和烯類成分，這些成分有廣泛的活性，有些已被用作名貴的香料，有些具有很好的藥用價值。從成分分析結(jié)果來看，有必要對博落回?fù)]發(fā)油香味成分、防治害蟲和抗腫瘤活性進一步研究，為充分開發(fā)利用博落回資源提供科學(xué)依據(jù)。