基于極大似然法的超分辨熒光顯微成像方法研究

張賽文，曹艷青*，冷瀟泠，譚偉石

(1. 湖南城市學(xué)院 信息與電子工程學(xué)院，湖南 益陽 413000；2. 全固態(tài)儲能材料與器件湖南省重點實驗室，湖南 益陽 413000)

細(xì)胞與亞細(xì)胞水平的生物學(xué)過程知識大多來自于直接的可視化方式.而在各種各樣的顯微技術(shù)中，熒光顯微技術(shù)由于具有可以通過分子特異性標(biāo)記來觀察特定的細(xì)胞成分和實時觀察活體樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)2 個主要優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用.在熒光顯微技術(shù)中，單分子定位是一種極具代表性的超分辨熒光成像方法[1].定位超分辨成像技術(shù)是把熒光分子圖像通過高精度的分子定位算法重建成超分辨圖像，達(dá)到20～30 nm 超高空間分辨率，可以為生物醫(yī)學(xué)等方面的研究提供極其寶貴的數(shù)據(jù)[2].熒光標(biāo)記，如熒光蛋白和量子點，已經(jīng)成為生物學(xué)中一種寶貴的工具，它們可以研究活細(xì)胞和有機(jī)體的分子動力學(xué)與相互作用[3].隨著熒光標(biāo)記技術(shù)和先進(jìn)的熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)，特別是來源于熒光顯微鏡的超分辨率成像技術(shù)[4]，人們現(xiàn)在可以深入了解具有高時空分辨率的活細(xì)胞的動態(tài)過程[5].然而，衍射極限的存在使 2 個物點的像相互靠近后不能很好地進(jìn)行區(qū)分，因此限制了系統(tǒng)的分辨率[6].依賴單個熒光分子探針的檢測和定位來重建超分辨圖像的光激活定位顯微術(shù)(Photoactivated Localization Microscopy, PALM)[7]以及隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)[1,8]，可以克服上述缺點，其分辨率不受遠(yuǎn)場衍射的限制.

在低密度熒光分子圖像的單分子定位中，最簡單的方法就是采用質(zhì)心定位算法[9]，此方法計算速度快，但是定位精度不高.最為廣泛采用的方法是高斯函數(shù)進(jìn)行最小二乘擬合，此方法精度高，但計算速度慢[1,8,10].還有學(xué)者把點擴(kuò)展函數(shù)轉(zhuǎn)換到頻率域中進(jìn)行計算，提高了計算速度，實現(xiàn)了在超分辨熒光成像中的應(yīng)用[11-12].極大似然法(Maximum Likelihood Estimation, MLE)在超分辨圖像的重建中也有大量應(yīng)用[13-17].在采用MLE 算法實現(xiàn)熒光分子定位時，利用點擴(kuò)展函數(shù)(Point Spread Function, PSF)的可分離特性，可以顯著減少重構(gòu)時間[16].為了同時實現(xiàn)多個分子定位，有人對極大似然法進(jìn)行了改進(jìn)，采用了計算科學(xué)里著名的分而治之策略，提出了一種基于擬合的方法(QC-STORM)，可以快速實現(xiàn)多個分子定位[18].為了提高重構(gòu)熒光分子圖像的密度，出現(xiàn)了一系列方法，如采用結(jié)構(gòu)稀疏模型與貝葉斯信息判據(jù)的方法[19]、采用壓縮感知的方法[20-24]和深度學(xué)習(xí)算法[25]等.

本文根據(jù)點擴(kuò)展函數(shù)理論[12]和熒光成像技術(shù)，采用 MATLAB 軟件模擬生成隨機(jī)分布的熒光分子圖像.首先，對模擬的熒光圖像和實際生物樣品圖像進(jìn)行解卷積降噪和二值化去背景，以提取單個分子所在區(qū)域的圖像；其次，建立極大似然模型，并通過 MATLAB 優(yōu)化工具箱對提取的圖像進(jìn)行定位以驗證算法的可行性；最后，通過模擬生成有結(jié)構(gòu)的樣品生物圖像和實際的生物樣品圖像，采用本文所提算法對每一幀圖像進(jìn)行定位，以實現(xiàn)超分辨圖像的重構(gòu).

1 單分子定位方法

1.1 成像原理和點擴(kuò)散函數(shù)理論

PSF 被廣泛應(yīng)用于描述處于焦平面的獨立熒光分子的光學(xué)系統(tǒng)成像，該函數(shù)可以近似采用二維的高斯函數(shù)代替[26]，即

其中，A 表示幅度，即信號峰值的強(qiáng)度；b 為信號附加的噪聲；σ 是高斯核函數(shù)的寬度.

在 STORM 成像中，假設(shè)每個輻射源(分子)發(fā)光都是獨立的，即強(qiáng)度屬于非相干疊加，那么多個分子發(fā)光所成的像是由點擴(kuò)展函數(shù)與分子的熒光強(qiáng)度分布函數(shù)卷積而成[20].因卷積可以寫成求和的形式，所以觀測信號[19,27]可表示為

1.2 極大似然模型

目前，極大似然法是一種被廣泛應(yīng)用的統(tǒng)計方法[14-15,28]，其基礎(chǔ)是最大似然估計原理.極大似然法為給定的參考數(shù)據(jù)提供了一種評估模型函數(shù)，即“模型已定，參數(shù)未知”.通過多次試驗的觀察和對比，最終發(fā)現(xiàn)能夠使樣本呈現(xiàn)的概率為最大化某個參數(shù)值的試驗結(jié)果.

在已知熒光分子的輻射模型的基礎(chǔ)上，極大似然法(MLE)可以通過調(diào)整模型函數(shù)中的參數(shù)(包括熒光分子的位置)，來得到最大光強(qiáng)的空間聯(lián)合分布.若假設(shè)像素(i, j) 處檢測到q 個光子的概率為

2 模擬結(jié)果與討論

2.1 隨機(jī)熒光分子圖像的模擬和定位

根據(jù)熒光顯微成像原理，讓每個熒光分子發(fā)射的光子數(shù)服從對數(shù)正態(tài)分布，其峰值為 5 000光子數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)差為2 000 光子數(shù)；設(shè)置物鏡的數(shù)值孔徑為1.2，發(fā)射波長λ 為660 nm，有效像元尺寸為100 nm；模擬生成熒光圖像后，每個像素添加70 個光子數(shù)的背景噪聲并進(jìn)行泊松化[30]；每個熒光分子經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)后生成的圖像對應(yīng)一個二維的高斯函數(shù)，模擬生成的50 個熒光分子隨機(jī)分布在像元數(shù)為128×128 pixels 圖像上，結(jié)果如圖1 所示.

圖1 模擬生成的熒光分子圖像

為了定位所有熒光分子的位置，需要對熒光分子圖像進(jìn)行預(yù)處理.首先，采用解卷積算法消除部分高斯白噪聲；然后，采用二值法清除背景噪聲，結(jié)果如圖2(b)所示.根據(jù)PSF 所占像素的個數(shù)，取出比PSF 更大的區(qū)域(此模擬實驗圖像大小為7×7 像素)，并采用極大似然法對子區(qū)域進(jìn)行分析和定位，將結(jié)果以坐標(biāo)形式顯示并存儲，其提取區(qū)域和定位圖像如圖 2(c)所示(坐標(biāo)位置用“+”顯示).從圖 2(c)中可以看出，當(dāng)分子比較稀疏時，可以精確定位；當(dāng)熒光分子靠得比較近時，則會影響旁邊的熒光分子的定位精度.所以，在用激光激發(fā)熒光分子時，應(yīng)盡量使分子稀疏分布，以提高定位精度.進(jìn)一步將分子定位坐標(biāo)反饋到原圖像進(jìn)行對比，結(jié)果如圖2(d)所示.

圖2 隨機(jī)熒光分子的定位

2.2 有結(jié)構(gòu)的熒光分子圖像模擬和定位

為了驗證極大似然法可以實現(xiàn)超分辨熒光圖像重構(gòu)，模擬生成10 條熒光分子帶，每2 條分子帶間的距離分別為20，50，100，200 和400 nm，其圖像大小為64×64 個像素，像素的有效像元尺寸為100 nm×100 nm.為了讓熒光分子處于稀疏狀態(tài)(即盡量不重疊)，讓每幀圖像都只有 8 個分子隨機(jī)分布在其上.根據(jù)點擴(kuò)展函數(shù)理論，生成的其中1 幀圖像如圖3(a)所示；對每個熒光光斑提取其子區(qū)域，如圖 3(b)方框所示，進(jìn)一步對子區(qū)域用極大似然法進(jìn)行精確定位，如圖 3(b)方框內(nèi)紅點所示；生成隨機(jī)分布的熒光分子圖像5 000幀，共40 000 個分子，對5 000 幀圖像直接累加生成的寬場圖像如圖 3(c)所示；對每幀圖像單獨進(jìn)行定位，并且記錄其中每個熒光分子的位置坐標(biāo)(為了將坐標(biāo)用圖像進(jìn)行顯示，對每個像素進(jìn)行10 倍細(xì)分，坐標(biāo)落入細(xì)分像素里的分子，其灰度值加1)，結(jié)果如圖3(d)所示.

圖3 熒光分子條帶的定位

與圖 3(c)對比，可以看出圖 3(d)的分子條帶分辨率明顯有了很大的提高.取圖 3(c)～(d)中 y方向的灰度圖像進(jìn)行對比，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 圖3(c)～(d)中y 方向的歸一化強(qiáng)度分布

從圖4 可以看出，寬場圖像離得較近的3 條分子條帶無法分辨.2 條分子帶的間距＜100 nm時，寬場圖像不能分辨；分子帶的間距＞200 nm時，雖有2 個峰，但是分辨能力不強(qiáng)；而采用極大似然法進(jìn)行定位，當(dāng)分子帶間距接近20 nm 時，也可以區(qū)分，如圖4 中左邊虛線的2 個峰值.

為了進(jìn)一步驗證極大似然法的性能，讓熒光分子分布在2 個靠近的圓環(huán)上，圖像大小和每幀熒光分子數(shù)同模擬熒光分子條帶一樣，光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)與2.1節(jié)相同.模擬生成的5 000幀熒光分子圖像的累加寬場圖像如圖 5(a)所示，圖中比例尺為1 μm.從圖5(a)可以看出，當(dāng)2 個圓環(huán)比較靠近時，無法進(jìn)行分辨.采用極大似然法對每幀熒光分子圖像進(jìn)行定位，每個定位的熒光分子坐標(biāo)采用熒光分子條帶的結(jié)果顯示方法顯示，如圖5(b)所示.從圖 5(b)可看出，圓環(huán)變得更細(xì)、更清晰，在圖 5(a)中不能分辨的地方，也可以予以區(qū)分.

圖5 2 個靠近圓環(huán)上的熒光分子定位

為便于比較，取圖 5(a)～(b)中豎線所示圖像的灰度值進(jìn)行對比顯示，結(jié)果如圖6 所示.圖6中點實線代表從寬場圖像中取出的灰度值，虛線代表從超分重構(gòu)圖像中取出的灰度值.

圖6 圖5(a)～(b)中豎線位置的歸一化強(qiáng)度分布

從圖6 可以看出，在寬場圖像中不能分辨的位置，在虛線中可以清楚地看到2 個峰，這說明分辨能力得到了明顯提升.

3 實驗結(jié)果與討論

為了驗證算法的實用性，從國外的公開網(wǎng)站(http://bigwww.epfl.ch/smlm/datasets/index.html?p=tubulin-conjal647)上獲取13 000幀由光學(xué)系統(tǒng)采集的長序列實驗圖像，每幀圖像都是稀疏分布，確保定位能夠準(zhǔn)確.對獲取的所有圖像取其大小為100×100 像素，對這13 000 幀圖像進(jìn)行累加的寬場圖像如圖 7(a)所示.為使重構(gòu)結(jié)果更加清晰，對定位后重構(gòu)的結(jié)果取對數(shù)進(jìn)行顯示，如圖7(b)所示.

圖7 實際生物樣品的定位重構(gòu)

從圖 7(b)可以看出，分辨率有了很大提高，在寬場圖像中不能分辨的2 條微絲，經(jīng)過重構(gòu)處理后，可以明顯區(qū)分.為了進(jìn)一步比較，取圖7(a)～(b)中橫線位置的灰度值進(jìn)行對比，結(jié)果如圖8所示.圖8 中點實線代表從寬場圖像中取出的灰度值，虛線代表從超分圖像中取出的灰度值.

圖8 圖7(a)～(b)中橫線位置的歸一化強(qiáng)度分布

從圖 8 可看出，寬場圖像(點實線)只有 1 個峰，而重構(gòu)圖像(虛線)有2 個峰值，可以分辨.

4 結(jié)論

采用極大似然法可以實現(xiàn)單分子定位，并獲得超分辨熒光圖像.本研究分別對模擬的分子條帶和2 個相鄰圓環(huán)的結(jié)構(gòu)樣品，以及實際生物樣品進(jìn)行了分子定位，并且實現(xiàn)了超分辨熒光圖像重構(gòu).結(jié)果顯示，圖像分辨率均得到了顯著提高，這說明此方法具有一定的實用價值.然而，此方法也存在一定的局限性，即當(dāng)分子密度足夠高時，熒光分子圖像就會發(fā)生重疊，從而導(dǎo)致單個分子圖像的區(qū)域無法準(zhǔn)確提取和定位.