ELISA法檢測HIV抗體的影響因素

王俊瑤，周玉梅，李妍妍

(1.鄭州市第三人民醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院 呼吸科一病區(qū)，河南 鄭州 450018)

近年來，艾滋病感染率有所上升，臨床防治形勢嚴峻，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗體檢測顯得尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是檢測各種抗體、抗原的常用方法，具有特異性強、敏感度高、可重復性等優(yōu)勢，且試劑較為穩(wěn)定，操作方便，適用于大規(guī)模篩查[1]。但ELISA檢測結(jié)果受多種因素影響，如何避免影響因素干擾以提高臨床診斷準確率，是臨床研究重點關注方向?；诖?，本研究探討ELISA法檢測HIV抗體的影響因素。

1 資料與方法

1.1 標本來源收集鄭州市第三人民醫(yī)院2017年10月至2019年10月接受HIV抗體篩查的3 144例血液標本進行檢測，其中初診疑似HIV陽性標本11例，經(jīng)確認HIV陽性4例。

1.2 試劑(1)選擇：選擇特異度、敏感度較好、經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準的試劑，若更換試劑批號則需進行平行試驗，嚴格在有效期內(nèi)使用。(2)預處理：檢測前將試劑盒與室溫下放置20～30 min，盡量與室溫保持一致。(3)內(nèi)部對照：進行試劑盒所提供陰性、陽性血清對照，內(nèi)部對照無效則需再次檢測；注意內(nèi)部對照僅限于同批號。(4)本研究所用試劑分別為：武漢生物制品研究所有限責任公司，國藥準字S19991013；河南華美生物工程有限公司，國藥準字S20010066。

1.3 溫度(1)于恒溫箱內(nèi)放置溫度計，避免實際溫度與恒溫箱顯示溫度存在差異。(2)預先評估不同季節(jié)微孔板從室溫拿到溫箱后孔內(nèi)溫度達到37 ℃所用時間，確保設定溫度下反應時間充足，將溫度計置于微孔板溶液進行觀察。(3)本研究所用溫度計均經(jīng)相關部門檢測合格。

1.4 其他因素(1)加樣操作時注意勿出現(xiàn)氣泡，勿觸及孔壁，加樣完成后混勻，覆膜。(2)反應板浸泡時間、洗滌次數(shù)可對檢測結(jié)果造成影響，一般每次浸泡50 s，洗滌5～6次。(3)檢測標本吸光度前進行酶標儀預熱，時間>20 min，判讀時間<15 min。

1.5 檢測方法參照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》進行檢測，雙波長450 nm/ 630 nm，標本值<0.1+陰性對照值均值則為陰性，≥0.1+陰性對照值均值則為陽性，陰性對照值>0.1且陽性對照值<0.5表明檢測失敗。連續(xù)檢測4次。

1.6 觀察指標(1) ELISA法進行HIV抗體篩查結(jié)果及市疾病防控中心確認結(jié)果；(2) ELISA法檢測HIV抗體的影響因素。

2 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果3 144例血液標本經(jīng)兩種試劑盒4次檢測結(jié)果均一致，陽性11例，陽性率為0.35%。見表1。送至本市疾病防控中心確認，陽性4例，陽性率為0.13%。

表1 兩種試劑盒4次檢測結(jié)果(n)

2.2 影響因素ELISA檢測HIV抗體過程中7例假陽性影響因素分別為：1例由于血液標本未妥善處理，受異嗜性抗體影響；3例血液標本污染；3例血液標本出現(xiàn)溶血。

3 討論

現(xiàn)階段，我國HIV感染者較多，但感染者對自身健康狀況并不了解，通過抗體檢測才能最終確認。因此，提高臨床篩查準確度，避免檢測過程中影響因素干擾尤為重要。本研究結(jié)合臨床經(jīng)驗分析HIV抗體ELISA檢測過程各個階段，以找出對檢測結(jié)果存在影響的相關因素，提出干預措施進行預防，達到減少假陽性、假陰性的目的。

血液標本是臨床檢測主體，若標本受到污染，出現(xiàn)溶血，貯存不當及處理不當?shù)纫子绊憴z測結(jié)果，從而出現(xiàn)假陰性、假陽性情況。血液標本影響因素分為內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，其中外源性主要為標本采集、運送、貯存過程中出現(xiàn)問題，導致標本受污染或溶血，另外貯存時間過長、抗凝物加入同樣會影響檢測結(jié)果[2]。本研究應對措施如下：標本采集避免溶血，采集后自然放置1～2 h，血塊收縮、血液凝固后進行離心處理，血清立即檢測，若保存時間>7 d則保存于-20 ℃環(huán)境中；需抗凝時避免使用酶抑制劑，防止降低酶活性。內(nèi)源性干擾因素主要指類風濕因子、補體、異嗜性抗體、非特異性免疫球蛋白等[3]。本研究應對措施如下：給予 pH=7.2的0.01 mol·L-1磷酸鹽進行稀釋，比例為1∶1，進行血清滅活30 min，溫度56 ℃。

試劑選擇需經(jīng)注冊批準且檢驗合格，經(jīng)臨床評估結(jié)果、鑒定報告等對比后選擇特異度、靈敏度較高的試劑盒，注意在有效期；檢測前的預處理十分重要，但基層檢驗人員易忽略。本研究則在檢測前將其取出置于室溫下放置20～30 min，保證使用前與室溫盡量一致，避免由于溫度原因影響抗體抗原反應速度，進而影響檢測結(jié)果；對同批號試劑盒進行內(nèi)部對照，確保試驗有效性。

標本質(zhì)量對臨床檢測過程極為重要，血清是臨床最常用標本，血清分離時必須完全徹底分離，避免出現(xiàn)纖維蛋白伴血清標本加入反應孔而在孔底吸附，造成假陽性。血清標本需冷凍保存，注意保存時勿反復凍融，其原因在于標本反復凍融會產(chǎn)生機械剪切力，破壞蛋白分子，導致假陰性[4]。另外，溶血標本所出現(xiàn)的游離血紅蛋白具有過氧化物酶作用，可通過催化辣根過氧化物酶底物顯色造成假陽性[5-6]。但臨床實際操作時、試驗前均會進行2次洗板，將參與的游離血紅蛋白清除，使其對臨床檢測幾乎無影響。

儀器及操作人員技術(shù)對臨床檢測結(jié)果有一定的影響，HIV抗體檢測需嚴格遵守《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》流程。操作人員須嚴格消毒，穿戴工作衣、手套，按照說明書規(guī)范使用移液器，加樣時孔內(nèi)按照規(guī)定量添加，勿在邊緣位置加樣，注意吸頭勿碰到抗原，快放慢吸，避免濺出、出現(xiàn)氣泡；加樣完成更換吸頭，避免交叉感染；滴加試劑前搖勻，并將第1滴擠去，避免出現(xiàn)氣泡；移液器需定期校正。ELISA判斷結(jié)果為酶催化底物顯色，而酶催化底物、抗體抗原結(jié)合效率均與溫度密切相關：溫度過高則顯色較深，溫度較低則顯色較淺，對臨床檢測結(jié)果準確性有明顯影響[7-8]。溫度對ELISA檢測成功與否十分關鍵[9-10]。ELISA檢測時控制溫度后需調(diào)控恒溫箱，在明確恒溫箱面板溫度的同時，在箱內(nèi)放置溫度計，避免溫差影響檢測結(jié)果；抗體最合適反應溫度為37 ℃，保證抗體抗原充足的反應時間。另外，洗板對ELISA檢測非常關鍵，參照說明書設置洗滌次數(shù)、浸泡時間，完成后還應以蒸餾水進行沖洗，避免堵塞；注意試劑盒洗滌劑勿混合使用，使用不同酶標板時調(diào)整吸液頭，避免卡住，及時更換破損吸液頭。

綜上，ELISA法檢測HIV抗體影響因素涉及標本、采集、試劑選擇和處理、溫度調(diào)控、操作人員技術(shù)等各個方面。通過對標本、試劑、溫度及操作流程進行干預，可有效避免假陽性、假陰性出現(xiàn)。臨床應消除影響因素干擾，提高檢測準確率，確保檢測結(jié)果準確可靠。