口腔鱗狀細(xì)胞癌外周血、癌組織及癌旁組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)及臨床意義

閆秋杰，南麗君，趙芳源，李俊冉，張媛媛

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔科，河南 鄭州 450052)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例約35萬例[1]。雖然近年來OSCC的診斷方法及綜合治療不斷改進(jìn)，但OSCC的5 a生存率仍僅為50%左右[2]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。負(fù)性共刺激分子常位于T淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面，在多種腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，使T淋巴細(xì)胞功能發(fā)生障礙，直接或間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤治療失敗。目前，針對(duì)免疫檢驗(yàn)點(diǎn)PD-1單克隆抗體已被批準(zhǔn)用于治療OSCC在內(nèi)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，然而由于患者體內(nèi)免疫耐受的產(chǎn)生，單一的免疫治療效果并不理想。故采用聯(lián)合免疫治療來控制疾病的進(jìn)展。有研究報(bào)道，T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin molecule-3，TIM-3)是大多數(shù)免疫細(xì)胞表面共抑制分子，半乳凝素-9是其配體，兩者結(jié)合后可以抑制免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[3]。已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)TIM-3在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，TIM-3表達(dá)在OSCC中的生物學(xué)和臨床價(jià)值尚未得到系統(tǒng)的闡明。本研究觀察OSCC患者外周血、癌組織及癌旁組織中T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)情況，并分析其臨床意義，旨在探討TIM-3與疾病的關(guān)系，為OSCC的免疫靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2019年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的41例OSCC患者作為OSCC組，其中男25例，女16例，年齡36～87歲，平均(61.24±12.91)歲。選取同時(shí)期在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受體檢的20例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男13例，女7例，年齡37～83歲，平均(59.00±11.17)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。受試者知曉本研究內(nèi)容并簽署同意書。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)(1)選取標(biāo)準(zhǔn)：①首次診斷為OSCC，且經(jīng)病理HE染色確診；②臨床病理資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往放化療及免疫治療史；②非原發(fā)腫瘤，或合并其他腫瘤；③伴有其他的口腔黏膜病，如口腔白斑、口腔扁平苔蘚等；④合并其他系統(tǒng)性疾病。

1.3 標(biāo)本采集與制備清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集受試者2 mL外周靜脈血，置于肝素抗凝管內(nèi)，2 h內(nèi)上機(jī)檢測。收集手術(shù)切除的OSCC組織以及癌旁2 cm以上的正常組織標(biāo)本(蘇木精-伊紅染色證實(shí)無腫瘤細(xì)胞)。樣本制備：取部分癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織在無菌操作臺(tái)上剪成約1 mm3的碎塊，分別加入含有鏈霉素(500 mg·L-1)、青霉素(500 IU·mL-1)及慶大霉素(900 IU·mL-1)的培養(yǎng)液內(nèi)，并放入消化酶混合液中(體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清，1 mg·L-1的CollagenaseⅠ、CollagenaseⅣ，25 mg·L-1的脫氧核糖核酸酶)消化30 min，采用100目濾網(wǎng)過濾溶液制備單細(xì)胞懸液。

1.4 檢測方法流式法檢測在CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)。取外周抗凝血、癌組織及癌旁組織單細(xì)胞懸液各100 μL分別置于EP管中，然后分別加入熒光標(biāo)記(抗TIM-3-PE，抗FITC-CD8、抗PerCP-Cy5.5-CD4、抗APC-PD-1)抗體各5 μL至相應(yīng)流式細(xì)胞管中，同型對(duì)照組各加入5 μL對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體。避光孵育20 min后，于外周血離心管內(nèi)分別加入1×的紅細(xì)胞裂解液2 mL，震蕩混勻，避光孵育15 min。癌組織和癌旁組織則無需此過程。取2 mL PBS緩沖液重懸洗滌2次，離心，棄上清。采用流式細(xì)胞儀BD FACSCantoTMⅡ上機(jī)分析。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組和對(duì)照組外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)OSCC組外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3表達(dá)水平[(4.02±0.68)%、(4.22±0.72)%]較對(duì)照組[(0.94±0.42)%、(1.24±0.65)%]高(t1=21.683，P1<0.001；t2=16.213，P2<0.001)。見圖1。

圖1 OSCC組和對(duì)照組外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平

2.2 癌組織與癌旁組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)OSCC癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3表達(dá)水平[(23.03±3.61)%、(24.33 ±3.83)%]較對(duì)照組[(10.84±2.03)%、(10.62±1.28)%]高(t1=14.656，P1<0.001；t2=16.624，P2<0.001)。見圖2。

圖2 OSCC患者癌組織和癌旁組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平

2.3 OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期無關(guān)(P>0.05)。見表1、2。

表1 OSCC患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2 OSCC患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 OSCC患者癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系TIM-3在OSCC患者癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。見表3、4。

表3 OSCC患者癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表4 OSCC癌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

負(fù)性共刺激分子介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞功能障礙機(jī)制復(fù)雜，研究報(bào)道單純抗PD-1/PD-L1治療有效率低[4]。Shayan等[5]研究顯示，應(yīng)用PD-1阻斷劑治療頭頸部腫瘤有效率<20%，這些提示僅阻斷PD-1/PD-L1并不能完全恢復(fù)T淋巴細(xì)胞功能，可能存在多種負(fù)調(diào)控途徑參與抗腫瘤免疫反應(yīng)。TIM-3是除PD-1之外重要的T淋巴細(xì)胞耗竭標(biāo)志，應(yīng)用PD-1阻斷劑后TIM-3補(bǔ)償性上調(diào)，TIM-3的上調(diào)可抑制T淋巴細(xì)胞的免疫功能，雙重阻斷TIM-3和PD-1可以恢復(fù)耗竭性T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力，增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)。TIM-3在CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)與各種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但對(duì)TIM-3在OSCC患者CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)相關(guān)研究較少。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測OSCC患者外周血、癌組織及癌旁組織中T淋巴細(xì)胞上TIM-3表達(dá)情況，探討其與OSCC臨床病理特征的關(guān)系，為OSCC的免疫靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

T淋巴細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答在腫瘤發(fā)生發(fā)展中處于核心地位[5]。成熟的T淋巴細(xì)胞表面僅表達(dá)CD4+或CD8+[6]。CD4+輔助T淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫反應(yīng)的招募、激活和調(diào)節(jié)多個(gè)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生依賴于激活的CD4+T淋巴細(xì)胞的幫助。CD8+T淋巴細(xì)胞能特異性識(shí)別MHC-Ⅰ類分子呈遞內(nèi)源性抗原，CD4+T淋巴細(xì)胞輔助CD8+T淋巴細(xì)胞參與腫瘤免疫反應(yīng)，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。研究表明，相比于PD-1，TIM-3更能作為體內(nèi)T淋巴細(xì)胞耗竭的標(biāo)志物，PD-1-TIM-3+CD8+T淋巴細(xì)胞使T淋巴細(xì)胞增殖分泌能力降低，而PD-1+TIM-3-CD8+T淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞功能無明顯相關(guān)性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，OSCC患者外周血CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3表達(dá)水平均高于對(duì)照組，與結(jié)腸癌、骨肉瘤及OSCC體內(nèi)研究結(jié)果[9-11]一致，提示TIM-3在OSCC患者CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上高表達(dá)可能抑制下游信號(hào)通路及細(xì)胞因子的分泌，致使外周T淋巴細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，OSCC患者癌組織CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3表達(dá)水平高于癌旁組織，與徐本玲等[12]研究結(jié)果一致，提示宿主與腫瘤之間的免疫反應(yīng)極其復(fù)雜，腫瘤微環(huán)境中可能存在誘導(dǎo)其表達(dá)的因素，致使CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，從而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境免疫抑制，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，OSCC患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期無關(guān)，僅與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與以往的研究結(jié)果[10]一致，表明TIM-3在OSCC的發(fā)生發(fā)展中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能使T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，耗竭性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力減弱，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)一步轉(zhuǎn)移[13]。Cheng等[14]研究顯示胃癌癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理特征相關(guān)，而本研究中OSCC癌組織中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)水平與年齡、性別、部位、腫瘤大小、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，可能是由于CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上TIM-3在不同腫瘤間表達(dá)存在差異。有研究證實(shí)，TIM-3、PD-1在多個(gè)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及外周血T淋巴細(xì)胞上均存在高表達(dá)、共表達(dá)現(xiàn)象，且與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15-16]。因此，TIM-3、PD-1在OSCC患者中的表達(dá)水平可共同作為判斷OSCC患者預(yù)后的參考指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果支持TIM-3參與OSCC的免疫逃逸，TIM-3的過表達(dá)與OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與OSCC的預(yù)后有關(guān)。但由于未對(duì)患者術(shù)后進(jìn)行長期隨訪，不能準(zhǔn)確分析患者的預(yù)后，這也將是下一步研究的重點(diǎn)。