龍血竭總黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清因子TNFα和IL6的影響研究

黃表華 劉燕 黃蘭松 黃照河

【摘要】 目的 通過檢測心肌缺血再灌注損傷大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）含量以及顯微鏡觀察心肌細胞病理學結(jié)構，探討龍血竭總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。

方法 將40只SD大鼠隨機分為4組：空白對照組（control組）、假手術組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+龍血竭總黃酮干預組（SDFI/R組），每組10只。I/R組及SDFI/R組進行心肌缺血再灌注損傷造模。所有大鼠均在相應處理后通過腹主動脈采血留取血清標本，通過ELISA法測定TNFα和IL6含量;留取結(jié)扎梗死相應部位心肌組織進行HE染色，顯微鏡下觀察其病理變化，并行qPCR檢測心肌組織TNFα和IL6的mRNA含量。

結(jié)果 大鼠心肌組織病理HE染色示：I/R組的心肌肌纖維有大范圍斷裂，結(jié)構最為紊亂，炎癥、水腫最明顯;SDFI/R組心肌細胞排列較規(guī)整，斷裂較少，組織間隙水腫較輕;control組及sham組差異不大，心肌組織無明顯變性，心肌纖維排列基本規(guī)整，組織間隙水腫最輕，損傷最小。不同組間的TNFα、IL6水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα、IL6水平均高于control組（P<0.05），SDFI/R組TNFα、IL6水平均低于I/R組（P<0.05）。不同組間的TNFα、IL6 mRNA 表達量比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα、IL6 mRNA水平高于control組（P<0.05），SDFI/R組、I/R組的TNFα、IL6 mRNA水平高于sham組（P<0.05），SDFI/R組的TNFα、IL6 mRNA水平低于I/R組（P<0.05）。

結(jié)論 龍血竭總黃酮可減少心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中的炎癥因子TNFα和IL6的釋放，從而保護心肌細胞組織。

【關鍵詞】 心肌缺血再灌注損傷;龍血竭總黃酮;TNFα;IL6

中圖分類號：R542. 文獻標志碼： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.002

Effects of Sanguis Draconis flavones on serum inflammatory cytokines TNFα and IL6 in myocardial ischemiareperfusion injury rats

HUANG Biaohua1， 2， LIU Yan1， HUNAG Lansong1， 2， HUANG Zhaohe1▲

（1. Department of Cardiology of Affiliated Hospital， 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To discuss the influence of Sanguis Draconis flavones （SDF） on myocardial ischemiareperfusion injury （MIRI） by detecting the content of serum tumor necrosis factorα （TNFα） and interleukin6 （IL6） in MIRI rats， and by observing pathological structure of cardiomyocytes of them under microscope.

Methods 40 SD rats were randomly divided into four groups： control group， sham group， ischemiareperfusion（I/R）group， and I/R + Sanguis Draconis flavones （SDFI/R） group， with 10 rats in each group. MIRI models were made in the I/R group and the SDFI/R group. Blood sample were collected from the abdominal aorta， and their serum TNFα and IL6 were detected by ELISA. Finally， the rats were sacrificed and their hearts were immediately taken out， the corresponding myocardial tissues were ligated for HE staining， the pathological changes were observed under microscope， and the mRNA content of TNFα and IL6 in myocardial tissues were detected by qPCR.

Results Pathological HE staining of the myocardial tissue of rats showed that myocardial muscle fibers in the I/R group had a wide range of breakage， the most disordered structure， and the most obvious inflammation and edema. In the SDFI/R group， the arrangement of myocardial cells was more regular， the rupture was less， and the interstitial edema was milder. There was no significant difference between the control group and the sham group， no obvious degeneration of the myocardial tissue was found， the arrangement of myocardial fibers was basically regular， the intertissue edema was the mildest， and the injury was the least. Difference of the TNFα and IL6 levels among groups was statistically significant （P < 0.01）， the TNFα and IL6 levels of the sham group， the I/R group， and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P < 0.05）， and those in the SDFI/R group were lower than those in the I/R group （P <0.05）. There was statistically significant difference in TNFα and IL6 mRNA expression levels （P < 0.001）. The TNFα and IL6 mRNA levels of the sham group， the I/R group and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P <0.05）， those of the SDFI/R group and the I/R group were higher than those of the sham group （P < 0.05）， and those of the SDFI/R group were lower than those of the I/R group （P <0.05）.

Conclusion SDF can reduce the release of inflammatory cytokines TNFα and IL6 in serum of rats with myocardial ischemiareperfusion injury， so as to protect myocardial tissue.

【Key words】 MIRI; SDF; TNFα; IL6

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢復血流再灌注后，反而加重其結(jié)構破壞，引起心肌細胞死亡，導致梗死范圍擴大，造成心功能的進一步損害并影響急性心肌梗死（AMI）患者的預后[1]。MIRI是AMI再灌注治療中最棘手的問題，嚴重影響AMI患者的預后，是當前國內(nèi)外學者研究的熱點。本實驗擬建立大鼠在體MIRI模型，研究龍血竭總黃酮對MIRI大鼠炎癥因子的影響;擬為探討中藥防治MIRI拓展新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD大鼠40只，7～8個周齡，體重（250±20）g，雌雄各半，健康狀況良好;由湖南省長沙市天勤生物技術有限公司提供（動物許可證號：SCXK〔湘〕20140011）;飼料由右江民族醫(yī)學院動物實驗中心提供;龍血竭粉劑由桂林三金制藥研究所提供。TNFα 定量ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供;IL6定量ELISA試劑盒由欣博盛生物科技有限公司提供;實時定量PCR引物及試劑由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.2 分組和給藥

將40只SD大鼠按隨機數(shù)字表分為4組：空白對照組（control組）、假手術組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+龍血竭總黃酮干預組（SDFI/R組），每組10只。control組不進行實驗前干預;sham組、I/R組每組實驗前分別給予0.9%生理鹽水（10 mL/kg）灌胃;SDFI/R組每天予大鼠龍血竭總黃酮灌胃預處理（180 mg/kg）[2]。連續(xù)灌胃28天后開始實驗造模。

1.3 實驗動物造模[3～4]

第29天手術，術前禁食12小時。在10%水合氯醛（350 mg·mL-1）[5]腹腔注射麻醉下，仰位固定大鼠，四肢皮下連接標準導聯(lián)心電圖監(jiān)測，前頸、胸備皮，切開頸前皮膚，鈍性分離出氣管，T型切開氣管，連接氣管插管后，連接小型動物用呼吸機（潮氣量為20～30 mL·kg-1，頻率70～80次·min-1）。在胸骨左緣旁0.3～0.5 cm處縱行切開第3～5肋 ， 小心剪開心包， 暴露心臟， 結(jié)扎冠狀動脈左前降支，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，缺血心肌顏色較相鄰區(qū)域變淺或變白，心電圖監(jiān)測顯示進行性心肌缺血變化后Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高證明造模成功，剪開縫扎線，進行再灌注120 min，造成MIRI模型[6]。假手術組的動物手術全過程與其他組相同，但只穿線不結(jié)扎冠脈，并在穿線后將心臟放回胸腔，適當閉合胸腔切口?？瞻讓φ战M不進行手術。

1.4 檢測各組TNFα和IL6含量

所有大鼠均在相應處理后通過腹主動脈采血并留取血清標本，嚴格按照ELISA方法規(guī)程步驟進行炎癥因子TNFα和IL6含量檢測，各組間進行對比。

1.5 鏡下觀察心肌細胞纖維的變化情況

同時采用腹腔動脈放血法處死大鼠后立即取出心臟，留取結(jié)扎相應部位心肌組織進行HE染色，鏡下觀察心肌細胞纖維的變化情況[7]。

1.6 檢測心肌組織TNFα、IL6的mRNA表達量

對目標心肌組織行qPCR檢測TNFα、IL6的mRNA表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用OneWay ANOVA方法進行統(tǒng)計分析，多組間兩兩比較采用SNK法，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 果

2.1 造模大鼠心電生理變化情況

觀察Ⅱ?qū)?lián)的心電圖改變，以造模30分鐘ST段抬高與0分鐘時比較超過2 mV，再灌注120 min 觀察到高聳的T波下降或者已抬高的ST段下降1/2以上為造模成功（如圖1）。

2.2 鏡下觀察各組大鼠心肌組織HE染色

通過閱片比較I/R組的心肌肌纖維有明顯斷裂，結(jié)構最為紊亂，心肌間隙炎癥、水腫最明顯，核周空泡最多，SDFI/R組與I/R組比較顯示排列較規(guī)整，斷裂較少，組織間隙水腫較輕，核周空泡形成較少;control組與sham組差異不大，心肌組織無明顯變性，心肌纖維排列基本規(guī)整，組織間隙無明顯水腫，未見明顯損傷（見圖2）。

2.3 檢測血清學TNFα和IL6含量

經(jīng)參照TNFα和IL6的ELISA試劑盒說明書，將已按濃度梯度稀釋后待測樣品，同標準品一起檢測，檢測出標準品OD值與濃度之間的標準曲線和相應公式（如圖3、圖4），將得到的在標準曲線范圍待測樣品OD值代入相應的標準曲線，再乘以相應稀釋的比例，得出各待測樣品的濃度。

不同組間的TNFα、IL6水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα、IL6水平均高于control組（P<0.05），SDFI/R組TNFα、IL6水平均低于I/R組（P<0.05）。見表1。說明了sham組在相應的手術干預150 min的時長后仍出現(xiàn)了與創(chuàng)傷性相應的炎癥反應。

2.4 qPCR檢測TNFα、IL6的mRNA表達量

不同組間的TNFα mRNA、IL6 mRNA 表達量比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于control組（P<0.05），SDFI/R組、I/R組的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于sham組（P<0.05），SDFI/R組的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平低于I/R組（P<0.05）。見表2。

3 論

《中國心血管病報告2018》指出，2016 年心血管病病死率仍居首位，高于腫瘤及其他疾病;中國城市和農(nóng)村居民冠心病病死率繼續(xù)保持2012 年以來的上升趨勢，農(nóng)村地區(qū)冠心病病死率上升趨勢明顯。最新歐洲心臟調(diào)查顯示：歐洲每年有4萬人死于心血管病，美國每年有90萬人患AMI，其中22.5萬人死亡。世界衛(wèi)生組織“全球疾病負擔研究”的統(tǒng)計數(shù)字預示，到2020年，中國每年因冠心病死亡的人數(shù)將有可能達到400萬[8～9]。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制較復雜，氧化損傷、鈣超載、炎性反應等眾多路徑及病理生理過程與之有關，而心肌缺血再灌注過程中創(chuàng)傷性炎癥的發(fā)生與心肌缺血再灌注損傷密切相關[10]。TNFα是分子量為17 kDa的可溶性多肽，是一種單核因子（炎癥因子），心肌的巨核細胞和單核細胞都可以合成產(chǎn)生TNFα，它具有廣泛的生物學效應，參與炎癥反應、介導休克、組織損傷的過程，也參與腫瘤細胞殺傷、調(diào)節(jié)細胞的增殖以及機體的免疫代謝等病理生理反應[11～12]。IL6是炎癥風暴中一個重要的因子，也是一種多效的細胞因子，在炎癥反應中起著調(diào)節(jié)作用;當炎癥急性期時，其往往起著抗炎的作用，伴隨著炎癥的進展，IL6的這種抗炎作用逐步轉(zhuǎn)成促炎效應，而出現(xiàn)對機體產(chǎn)生不利的影響。故IL6在急性心肌梗死過程中扮演著非常重要的角色，心肌壞死的面積與血漿中的IL6水平存在著正相關性[13]。

楊瀟等人[14]對中醫(yī)藥治療心肌缺血再灌注損傷的進展進行了總結(jié)，有用地黃多糖、梔子苷、復方參元丹等中藥進行了相關的研究，結(jié)果提示近年來中藥在防護心肌缺血再灌注損傷疾病方面具有獨特優(yōu)勢，已成為研究熱點。龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹 [Dracaena cochinchinensis （Lour.） S.C.Chen]的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，主產(chǎn)于我國廣西、海南、云南等地，史書上記載具有活血化瘀之功效，同時還有去腐生肌、止血等功效，目前臨床上常用于斂瘡生肌、外傷止血和治療靜脈炎等。張曉燕等[15]研究表明，龍血竭化學成分以及藥理作用與進口血竭接近，其主要成分為黃酮類、苯丙素類、皂苷類、甾醇類、木脂素類和二苯乙烯類等。而既往有多方面的學者針對龍血竭的作用從多方面多領域進行了研究，近期林憶龍等[16]對龍血竭的藥理研究表明，龍血竭具有抗炎、保護心血管、防輻射、抗纖維化、抑菌、促進創(chuàng)面愈合及保護中樞神經(jīng)等藥理作用。張鵬等人[17]在針對輻射所導致的神經(jīng)炎的研究中發(fā)現(xiàn)龍血竭的干預在這一過程發(fā)生中緩解了氧化應激水平及相關的炎癥因子的表達和線粒體的損傷程度;而張媛等人[18]在對皮膚病痤瘡的治療中也同時觀察在動物模型上運用了龍血竭的中藥干預后對TNFα、IL6的水平的調(diào)控作用，證實了龍血竭在抗炎方面所具備的功效。但龍血竭在心肌缺血再灌注損傷所導致的炎癥風暴中的作用尚未見文獻進行報道。結(jié)合實際診治中龍血竭提取物作為臨床治療常用活血中藥，有改善心肌缺血、抗血栓、抗炎、抗心律失常、調(diào)血脂等作用，特設計了本實驗過程及設想。

本實驗中，結(jié)扎了左前降支的大鼠心電圖在30 min時出現(xiàn)了ST段較術前顯著抬高、T波明顯高聳，心電圖提示出現(xiàn)心肌缺血的變化;再灌注120 mim時心電圖ST段較結(jié)扎30 min時明顯回落，T波下降超過1/3～1/2，說明左前降支恢復了血供，提示再灌注成功;有以上變化過程的心電圖顯示則表明造模成功。

大鼠目標心肌組織HE染色通過閱片比較各組結(jié)果，I/R組的結(jié)構最為紊亂，肌纖維有明顯斷裂，心肌核周空泡化、心肌間質(zhì)水腫最明顯;SDFI/R組與I/R對比，其心肌排列較規(guī)整，斷裂較少，組織間隙水腫較輕;從病理組織層面上再證實了造模的效果，同時從不同組別結(jié)果的比較中，提示了龍血竭總黃酮的預干預對心肌細胞組織的有效保護作用。

血清學的檢測研究結(jié)果顯示，大鼠在創(chuàng)傷及心肌缺血再灌注時會釋放TNFα、IL6，其檢測結(jié)果與缺血再灌注后的損傷程度呈正相關，表明了心肌對損傷應激反應之一是合成并釋放TNFα、IL6，而TNFα及IL6可誘導心肌細胞的凋亡[19]。本實驗的研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組的血清TNFα、IL6含量明顯高于其他三組;假手術組的TNFα、IL6檢測結(jié)果與正常對照組比較亦有升高，考慮假手術組在經(jīng)歷了頸部剝離氣管插管、開胸暴露心臟、冠脈左前降支的穿線后的手術干預下30 min（對應梗死時間）+120 min（對應再灌注時間）觀察期仍出現(xiàn)了可能與創(chuàng)傷性相關的炎癥反應，但其炎癥反應水平仍明顯低于結(jié)扎了左前降支而出現(xiàn)心肌梗死的缺血再灌注組和缺血再灌注+龍血竭總黃酮干預組;與缺血再灌注組比較，龍血竭總黃酮干預組的炎癥指標TNFα、IL6含量明顯減少，提示在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過程中，龍血竭總黃酮的干預可減少TNFα、IL6的釋放。實時定量PCR檢測TNFα、IL6的mRNA表達量的結(jié)果顯示，I/R組、SDFI/R組TNFα和IL6的mRNA表達量均有上升，而SDFI/R組的表達與I/R組表達比較有下調(diào)。同時證實了心肌缺血再灌注組損傷的大鼠誘發(fā)了炎癥反應過程，釋放了大量的腫瘤炎癥因子，其中就有TNFα與IL6;而龍血竭總黃酮的干預能抑制TNFα、IL6的釋放，結(jié)合病理讀片的結(jié)果，這種干預機制保護了心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌細胞組織。但其干預的機制尚未能明確，是否調(diào)控了腫瘤炎癥因子TNFα、IL6的上游某個通路，或是對相應下游的通路進行抑制，從而使得機體內(nèi)的腫瘤炎癥因子的釋放或者表達量下降。

既往的研究已表明，HIF可以通過誘導缺血預適應發(fā)揮心臟保護作用。缺氧誘導因子2α（Hypoxiainducible factor 2alpha，HIF2α）亞基是調(diào)節(jié)缺氧誘導因子（Hypoxiainducible factor 2，HIF2）活性的功能亞單位。韓永麗等[20]在探討電針內(nèi)關預處理對心肌缺血再灌注大鼠炎性因子TNFα、IL1β與MKK3/6p38MAPK通路的影響實驗中，得出了p38MAPK信號通路介導了電針內(nèi)關預處理對I/R大鼠心肌組織的保護作用，并且上游激活物包括參與炎癥反應和氧化應激反應的各類相關細胞因子，參與I/R的保護效應的結(jié)論。在這個過程中，TNFα作為p38MAPK信號通路上游激活物的炎癥反應因子。沈誠等人[21]曾在離體的心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟對JAK/STAT通路進行研究，他們團隊通過使用JAK抑制劑AG490，STAT抑制劑RMP，對通路蛋白進行干預，從而得出了抑制JAK/STAT通路的活化可下調(diào)心肌組織TNFα和IL6的表達，這可能有助于減輕缺血再灌注所致心肌損傷的結(jié)論。但這種通過抑制劑干預方式在臨床上大范圍的開展應用具有一定的難度，所以進行中醫(yī)藥的干預研究，是一個有意義和價值的探討方向。而龍血竭總黃酮是否會通過以上類似通路對心肌缺血再灌注損傷進行調(diào)控保護，仍需要進一步的實驗來發(fā)現(xiàn)與證明，因此深入而系統(tǒng)地進行研究十分必要。

參 考 文 獻

[1胡盛壽，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報告2018》概要[J].中國循環(huán)雜志，2019，34（3）：209220.

[2程初勇，潘小妮，劉文靜，等.龍血竭總黃酮對新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷作用的研究[J].心腦血管病防治，2017，17（3）：203204.

[3秦川.醫(yī)學實驗動物學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[4李平，金哈布日，張青山，等.蒙藥黃連4湯對心肌缺血再灌注損傷SD大鼠炎癥因子TNFα、IL6的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2017，5（33）：124125.

[5胡雄飛，陳志蓮，袁姝.戊巴比妥鈉與水合氯醛對大鼠麻醉效果的Meta分析[J].毒理學雜志，2020，34（3）：208213.

[6戴小華，韓寧林，周宜軒，等.益氣活血法對心肌缺血再灌注損傷大鼠腫瘤壞死因子α及丙二醛含量的影響[J].安徽中醫(yī)學院學報，2003，22（4）：3941.

[7MANDEL I A，PODOKSENOV Y K，SUHODOLO I V，et al.Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial ischemiareperfusion injury with cardiopulmonary bypass （experimental study）[J].Int J Mol Sci，2020，21（15）：5336.

[8IBEZ B，HEUSCH G，OVIZE M，et al.Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury[J].J Am Coll Cardiol，2015，65（14）：14541471.

[9FERDINANDY P，HAUSENLOY D J，HEUSCH G，et al.Interaction of risk factors，comorbidities，and comedications with ischemia/reperfusion injury and cardioprotection by preconditioning，postconditioning，and remote conditioning[J].Pharmacol Rev，2014，66（4）：11421174.

[10CADENAS S.ROS and redox signaling in myocardial ischemiareperfusion injury and cardioprotection[J].Free Radic Biol Med，2018，117：7689.

[11MORGAN M J，KIM Y S，LIU Z G.TNFalpha and reactive oxygen species in necrotic cell death[J].Cell Res，2008，18（3）：343349.

[12徐世安.大鼠心肌缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子的實驗研究[D].沈陽：中國醫(yī)科大學，2002.

[13吳佳緯.HIF2α轉(zhuǎn)錄調(diào)控IL6因子抗心肌缺血再灌注損傷作用的研究[D].濟南：山東大學，2020.

[14楊瀟，張瑞芬.中醫(yī)藥治療心肌缺血再灌注損傷的實驗研究進展[J].中醫(yī)藥學報，2019，47（1）：120123.

[15張曉燕，于瑩，徐峰，等.進口與國產(chǎn)血竭臨床治療作用機制研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2020，22（3）：107110.

[16林憶龍，文亦磊，黃洪，等.龍血竭化學成分及藥理作用研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2020，29（6）：5055.

[17張鵬，王海龍，馬宏，等.龍血竭對輻射誘導的神經(jīng)炎癥的保護作用[J].生物化學與生物物理進展，2020，47（8）：762767.

[18張媛，張榮平，張志畢，等.龍血竭凝膠對兔耳痤瘡模型TNFα、IL6和MFGE8的影響[J].中國皮膚性病學雜志，2021，35（1）：3036.

[19鄒吉麗，尹照萍，張利群，等.大鼠心肌缺血再灌注早期心肌及血清中IL6、TNFα的表達[J].中國醫(yī)科大學學報，2013，42（9）：830833.

[20韓永麗，吳松，陳松，等.電針內(nèi)關預處理對心肌缺血再灌注模型大鼠TNFα、IL1β與MKK3/6p38MAPK通路的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（12）：26452648.

[21沈誠，范士志，陳建明，等.抑制JAK/STAT通路對缺血再灌注損傷心肌TNFα和IL6表達的影響[J].重慶醫(yī)學，2006，35（1）：3839.

（收稿日期：2020-12-03 修回日期：2021-05-31）

（編輯：梁明佩）