全身交變電磁輻照療法對(duì)2 型糖尿病小鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用效果研究

蘭 娜，胡國花

（西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科，西安 710077）

0 引言

隨著生活水平的不斷提高，糖尿病已經(jīng)成為繼心腦血管病、腫瘤后影響人類健康的第三大因素。在所有糖尿病類型中，以2 型糖尿病最為常見，多發(fā)生于40 歲以上的中老年人[1-2]。2 型糖尿病患者人數(shù)占糖尿病患者的90%以上，也是最常見的嚴(yán)重危害中老年人健康的慢性疾病[3-4]。神經(jīng)病理性疼痛是2 型糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，40%～50%的糖尿病患者存在神經(jīng)病理性疼痛[5]。其臨床表現(xiàn)為持續(xù)灼痛、間斷刺痛、撕裂痛、電擊痛等自發(fā)性疼痛以及痛覺過敏和痛覺超敏等刺激誘發(fā)性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，疼痛長時(shí)間得不到解決則會(huì)出現(xiàn)抑郁甚至死亡。目前，臨床應(yīng)對(duì)2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的常用藥物包括鎮(zhèn)痛劑、抗抑郁藥、抗癲癇藥、血管擴(kuò)張劑、神經(jīng)營養(yǎng)劑等，但是對(duì)于疼痛的治療、改善效果十分有限，且會(huì)產(chǎn)生耐藥性[6-7]。交變電磁輻照作為一種臨床常見的物理治療方法，已經(jīng)在神經(jīng)損傷、骨骼肌創(chuàng)傷、心血管疾病康復(fù)中發(fā)揮積極作用[8-9]。研究也發(fā)現(xiàn)交變電磁輻照具有積極的抗炎和鎮(zhèn)痛療效[10-11]。但是目前國內(nèi)外尚未見交變電磁輻照對(duì)于糖尿病，尤其是發(fā)生率更高、危害更為廣泛的2 型糖尿病所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的治療效果的相關(guān)研究報(bào)道。本文以2 型糖尿?。╠b/db）小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)、神經(jīng)電生理、分子生物學(xué)檢測，旨在闡明交變電磁輻照對(duì)2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

血糖分析儀，購于美國Lifescan 公司；Von Frey纖維絲，購于美國Stoelting 公司；熱痛敏檢測系統(tǒng)，購于意大利Commat 公司；麻醉劑戊巴比妥鈉，購于美國Sigma 公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于北京天根生物技術(shù)公司；Maxima SYBR Green qPCR 試劑盒，購于美國Thermo 公司；Trizol（用于RNA 提?。?，購于美國Invitrogen 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2 型糖尿?。╠b/db）小鼠（C57BKS 背景，BKS.Cg-m+/+Leprdb/J），3 月齡，雄性，SPF 級(jí)，購于美國Jackson 實(shí)驗(yàn)室；與db/db 小鼠同背景的野生型小鼠，3 月齡，雄性，SPF 級(jí)，購于美國 Jackson 實(shí)驗(yàn)室。全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案遵從美國國立衛(wèi)生研究院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫22～24 ℃、恒濕50%～60%及恒定光照（12 h 光照、12 h 黑暗）的實(shí)驗(yàn)條件。全部動(dòng)物適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1 周，隨后通過尾靜脈提取靜脈血（晨血），測定隨機(jī)血糖值，血糖值＞16.7 mmol/L 且具有明顯多飲、多食、多尿特征的小鼠被納入本研究。30 只小鼠（20 只 db/db 小鼠及 10 只野生型小鼠）被分成3 組，每組10 只，分別為：野生型小鼠組（wild-type 組）、db/db 小鼠組（db/db 組）、db/db 小鼠接受交變電磁輻照（alternating electromagnetic fields，EMF）治療組（db/db+EMF 組）。其中，db/db+EMF 組小鼠給予全身交變電磁輻照刺激，每天1 h。wild-type 組和db/db 組的小鼠予以假交變電磁輻照暴露干預(yù)。

1.3 電磁照射裝置

電磁照射裝置由電磁發(fā)生器和Helmholtz 線圈組成。電磁發(fā)生器由MSP430 單片機(jī)控制產(chǎn)生頻率、強(qiáng)度線性可調(diào)的正弦交變電磁信號(hào)，該信號(hào)經(jīng)過后續(xù)的信號(hào)調(diào)制、整合、濾波、放大處理后，將電流輸出至Helmholtz 線圈。Helmholtz 線圈包含2 個(gè)相同直徑（40 cm）且等軸放置的線圈組，線圈匝數(shù)為100，線圈間距為20 cm。實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的交變電磁場峰值強(qiáng)度為5 mT，頻率為50 Hz。

1.4 行為學(xué)檢測

交變電磁輻照干預(yù)的第 0、1、2、3、4 周對(duì) 3 組小鼠分別進(jìn)行足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的測定分析。機(jī)械痛閾值檢測步驟：將小鼠置于單獨(dú)的鐵絲籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min 后，使用Von Frey 纖維絲對(duì)小鼠后足的足底給予刺激，在刺激過程中或移開纖維絲時(shí)，小鼠出現(xiàn)明顯的抬足反射則記錄為陽性，未出現(xiàn)抬足反射則記錄為陰性。每一標(biāo)號(hào)的纖維絲對(duì)每側(cè)足刺激5 次（雙側(cè)10 次），如出現(xiàn)5 次以上陽性反應(yīng)，則記錄該纖維絲力度為被采集指標(biāo)。如果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)5 次不抬腿的情況，則換用更高刻度的纖維絲。熱痛閾值檢測步驟：將小鼠置于單獨(dú)的塑料籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min。應(yīng)用熱輻射測痛儀發(fā)射光束照射小鼠足底中部，小鼠無法耐受熱痛出現(xiàn)抬足反射，此時(shí)光束自動(dòng)切斷，記錄反應(yīng)時(shí)間。每只小鼠單側(cè)足底刺激5 次（雙側(cè)共10 次），每次間隔10 min，記錄10 次的測量值并取平均值。

1.5 神經(jīng)電生理檢測

交變電磁輻照干預(yù)的第 0、1、2、3、4 周對(duì) 3 組小鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率（sensory nerve conduction velocity，SNCV）進(jìn)行測試。對(duì)各組小鼠行腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉，充分麻醉后將小鼠置于設(shè)有輔熱裝置的實(shí)驗(yàn)臺(tái)。將2 個(gè)刺激電極分別插入小鼠的膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)中，待電極植入穩(wěn)定后通入電流，采用生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄復(fù)合動(dòng)作電位的潛伏期（即神經(jīng)傳導(dǎo)時(shí)間），同時(shí)測定、記錄電極和刺激電極之間的沿著神經(jīng)走向的間隔距離，計(jì)算獲得神經(jīng)傳導(dǎo)速率。

1.6 分子生物學(xué)檢測

交變電磁輻照干預(yù)4 周后，對(duì)各組全部小鼠使用過量戊巴比妥鈉溶液處死。隨后通過RNA 提取試劑盒提取腰段脊髓L5 背角位置的總RNA，以2 μg RNA 為上樣量，在20 μL 反應(yīng)體系中對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR 儀對(duì)所選取目標(biāo)基因行PCR 擴(kuò)增，引物序列如下：白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）上游引物 5′-GTGGCTGTGGAGAAGCTGTGGC-3′，IL-1β 下游引物 5′-TGGG-TCCGACAGCACGAGGC-3′；p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）上游引物5′-TGAACTTCGCAAATGTATTTATTGGT-3′，p38 MAPK 下游引物 5′-ATCTGAGTCCAAAACGAGCATCT-3′；GAPDH（內(nèi)參基因）上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，GAPDH 下游引物 5′-TGTAGACCATGTAGTTGA GGTCA-3′。qPCR 的反應(yīng)體系為：cDNA 模板 1.6 μL，上、下引物（濃度為 10 μmol/L）各 0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，最后使用去離子水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20 μL。具體反應(yīng)條件為：95 ℃變性預(yù)處理 3 min，隨后 95 ℃變性 30 s、60 ℃退火 30 s，循環(huán) 40 次。每種基因設(shè)置 4 個(gè)復(fù)孔，使用 2-ΔΔCT法對(duì)p38 MAPK 和IL-1β 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

各組小鼠的體質(zhì)量比較如圖1（a）所示，可以看出，db/db 組小鼠的體質(zhì)量在4 周的實(shí)驗(yàn)期內(nèi)均顯著高于 wild-type 組小鼠（P＜0.05），同樣 db/db+EMF 組小鼠體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)也顯著高于wild-type 組小鼠（P＜0.05），但是 db/db 組與 db/db+EMF 組小鼠的體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組小鼠的血糖值比較如圖1（b）所示，可以看出，db/db 組和db/db+EMF 組小鼠的血糖值在各時(shí)間點(diǎn)顯著高于wild-type 組小鼠（P＜0.05），但 db/db 組與 db/db+EMF組之間的血糖值無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的影響

圖1 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

如圖 2（a）所示，與 wild-type 組相比，db/db 組小鼠的足底機(jī)械痛閾值在實(shí)驗(yàn)的第 0、1、2、3、4 周均顯著性降低（P＜0.05），db/db+EMF 組小鼠足底機(jī)械痛閾值在第0 周與db/db 組無明顯差異，但是在第1、2、3、4 周均顯著高于 db/db 組小鼠（P＜0.05），并且db/db+EMF 組小鼠足底機(jī)械痛閾值在第 2、3、4 周與wild-type 組小鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。如圖 2（b）所示，db/db 組小鼠足底熱痛閾值在實(shí)驗(yàn)的第0、1、2、3、4 周均顯著低于 wild-type 組小鼠（P＜0.05），db/db+EMF 組小鼠足底熱痛閾值在實(shí)驗(yàn)的第 1、2、3、4周均顯著高于 db/db 組小鼠（P＜0.05），同時(shí) db/db+EMF 組小鼠足底熱痛閾值在第3、4 周與wild-type組小鼠無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠SNCV 的影響

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)SNCV 的比較如圖3所示。db/db 組小鼠的 SNCV 在實(shí)驗(yàn)的第 0、1、2、3、4周均顯著低于 wild-type 組小鼠（P＜0.05）。db/db+EMF組小鼠的 SNCV 在第 0 周與 db/db 組無差異（P＞0.05），但在第 1、2、3、4 周均顯著高于 db/db 組小鼠（P＜0.05）。同時(shí)，db/db+EMF 組小鼠的 SNCV 在第 1、2、3、4 周均顯著低于 wild-type 組小鼠（P＜0.05）。

2.4 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠脊髓IL-1β和p38 MAPK 表達(dá)的影響

圖2 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的影響

圖3 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠SNCV 的影響

如圖 4 所示，db/db 組小鼠的脊髓 IL-1β 和 p38 MAPK 的基因表達(dá)水平均顯著高于wild-type 對(duì)照組小鼠（P＜0.05），db/db+EMF 組小鼠的脊髓 IL-1β 和p38 MAPK 的mRNA 表達(dá)含量顯著低于db/db 組小鼠（P＜0.05），而 db/db+EMF 組小鼠與 wild-type 組小鼠的脊髓IL-1β 和p38 MAPK 的基因表達(dá)水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

圖4 交變電磁輻照對(duì)db/db 小鼠脊髓IL-1β 和p38 MAPK 基因表達(dá)的影響

電磁輻照是臨床理療科重要的治療手段，已被證實(shí)能夠在加速骨折愈合、軟組織損傷修復(fù)、局部微循環(huán)改善、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙改善等方面發(fā)揮積極作用[12]。電磁輻照的治療波形多種多樣，包括穩(wěn)恒波式、脈沖波式、三角波式、正弦波式等，其中正弦交變電磁輻照憑借其更易獲取的優(yōu)勢（可直接從市電進(jìn)行轉(zhuǎn)換獲得）在臨床諸多疾病的治療中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，正弦交變電磁輻照具有消炎、鎮(zhèn)痛的功效[10-11]。但是，正弦電磁輻照是否能夠改善糖尿病尤其是2 型糖尿病的神經(jīng)病理性疼痛癥狀，目前仍是未知。本研究中，使用瘦素受體基因（db）純合突變的db/db 小鼠作為研究對(duì)象模擬臨床2 型糖尿病。該小鼠具有肥胖、高血糖、多尿、高尿糖等與人類2 型糖尿病諸多相似的體征，也是迄今研究2 型糖尿病及其并發(fā)癥最為經(jīng)典的動(dòng)物模型[13-14]。

為了檢測2 型糖尿病（db/db）小鼠機(jī)體對(duì)于外界刺激的承受能力，本研究分別進(jìn)行了足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的檢測，發(fā)現(xiàn)db/db 小鼠的足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值均顯著低于wild-type 組小鼠，提示該小鼠疼痛耐受能力顯著降低，這與臨床2 型糖尿病患者神經(jīng)病理性疼痛體征一致[15]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，全身交變電磁輻照1 周開始對(duì)db/db 小鼠的疼痛耐受能力產(chǎn)生顯著的改善效應(yīng)，并且隨著治療進(jìn)程的推進(jìn)，改善效應(yīng)越為明顯，在治療的第3 周基本可接近wild-type 組小鼠水平。本研究中對(duì)行為學(xué)的研究結(jié)果提示，全身交變電磁輻照對(duì)2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的癥狀改善具有顯著效果。

SNCV 是用于評(píng)定周圍神經(jīng)傳導(dǎo)功能的一項(xiàng)神經(jīng)電生理診斷技術(shù)，同時(shí)也是評(píng)價(jià)軸索損害的重要指標(biāo)[16]。學(xué)者們前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛患者的SNCV 顯著降低，且SNCV 的改變對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的敏感度高于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）的改變[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿?。╠b/db）小鼠在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的SNCV 均顯著低于wild-type 組，提示db/db 小鼠具有明顯的神經(jīng)傳遞障礙的特性。而使用交變電磁輻照后，db/db 小鼠SNCV 的降低得到了顯著改善，且這一效果在交變電磁輻照的早期表現(xiàn)得十分明顯，而上述變化趨勢也與足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的變化趨勢類似。本研究結(jié)果也提示SNCV是反映交變電磁輻照改善2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)性的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而IL-1β 是這其中最重要的促炎性細(xì)胞介質(zhì)，也被認(rèn)為是2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的重要標(biāo)志性細(xì)胞因子[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，db/db 小鼠脊髓中IL-1β 的基因表達(dá)含量顯著高于wild-type 組小鼠，這與前人的研究結(jié)果一致[20]，進(jìn)一步證實(shí)了2 型糖尿病會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體處于高炎性反應(yīng)狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，4 周的全身交變電磁輻照能夠顯著降低db/db 小鼠脊髓中IL-1β 的表達(dá)，降低至接近wild-type 組的水平（與wild-type 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），提示交變電磁輻照對(duì)2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的炎性反應(yīng)具有顯著的抑制效應(yīng)。

2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛會(huì)伴隨有諸多分子信號(hào)通路的激活，而近年來學(xué)者們的研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的多條信號(hào)通路會(huì)匯集于p38 MAPK 分子[21-22]。p38 MAPK 在激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、痛覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及神經(jīng)元可塑性變化中發(fā)揮重要作用，而對(duì)于p38 MAPK 高選擇性靶向藥物也是有前景的糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的潛在治療方式[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，db/db 小鼠脊髓中p38 MAPK 的基因表達(dá)顯著高于wild-type 組小鼠，進(jìn)一步證實(shí)了p38 MAPK 參與2 型糖尿病db/db 小鼠的神經(jīng)病理性疼痛進(jìn)程。而全身交變電磁輻照能夠顯著抑制脊髓p38 MAPK 的表達(dá)，提示交變電磁輻照對(duì)抗2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的潛在機(jī)制與其抑制p38 MAPK的表達(dá)有關(guān)。

本研究探究了4 周的全身交變電磁輻照對(duì)2 型糖尿病db/db 小鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療效果，明確了該方法能夠有效抑制2 型糖尿病db/db 小鼠的神經(jīng)病理性疼痛癥狀，并初步探索了該作用的潛在機(jī)制，有望為臨床對(duì)抗2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛提供新的治療策略。本研究的不足之處在于只從基因水平對(duì)脊髓重要細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行了定量分析，而未從蛋白的水平對(duì)脊髓重要細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行定量。在后續(xù)研究中，將通過在體基因沉默技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)一步闡明電磁輻照對(duì)2 型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛治療的潛在機(jī)制。