以脫細胞角膜基質(zhì)為載體的組織工程化兔角膜的構(gòu)建及移植*

徐婉欣, 凌玲, 查琴, 鐘姝, 姚玲, 柯慧敏, 陳敬旺, 陳磊, 詹桃, 周文天

南昌大學附屬眼科醫(yī)院角膜屈光科(江西南昌 330006)

近十年的研究表明，干細胞是多能的、緩慢循環(huán)再生的細胞[1]。角膜緣干細胞(LSCs)位于角膜緣上皮基底層,具有不斷增殖分化和向心性移動的能力[2- 3]。角膜緣干細胞給多種角膜緣干細胞缺乏或功能障礙引起的眼表疾病帶來了新的希望，如Stevens-Johnson綜合征、類天皰瘡綜合征、皰疹復合性疾病、眼的酸堿化學燒傷等，這些疾病可導致角膜結(jié)膜化、血管化、瘢痕化，最終視力大幅度下降，嚴重影響生活質(zhì)量[4-5]。近年來，隨著對角膜上皮干細胞生理的認識逐漸深入，角膜上皮干細胞移植研究取得了較大進展。自體角膜緣移植、異體角膜緣移植、體外培養(yǎng)的角膜上皮干細胞移植、口腔黏膜上皮細胞移植等已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床研究[6-8]。自體角膜上皮干細胞、口腔黏膜上皮干細胞是常用的細胞來源[9-11]。但是，自體角膜上皮干細胞來源少，且角膜上皮干細胞經(jīng)體外擴增后，不利于直接手術(shù)用于臨床上的角膜上皮干細胞移植。2017年11月至2019年12月，本研究擬利用以脫細胞角膜基質(zhì)為載體的角膜緣干細胞體外擴增技術(shù)，制備可用于臨床移植的含有角膜上皮干細胞的組織工程角膜，用于治療因角膜上皮干細胞缺乏所致的角膜病患者?；谕媒悄づc人角膜極其相似的特征，本研究用兔角膜緣干細胞來替代人角膜緣干細胞作為研究對象，以期為人角膜細胞的研究提供方法學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雄性新西蘭大白兔，體重2～2.5 kg，由南昌大學醫(yī)學院動科部提供，裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)未發(fā)現(xiàn)任何眼部疾患。

1.1.2 脫細胞豬角膜基質(zhì) 深圳艾尼爾角膜工程有限公司研發(fā)的“艾欣瞳”生物工程角膜。

1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM/F12混合液(Gibco公司)；青-鏈霉素混合液及PBS溶液(Solarbio公司)；胎牛血清(Gibco公司)；小鼠單克隆抗體角蛋白K3 (AE5、特異性識別K3)、驢抗小鼠二抗及山羊多克隆抗體P63(Abcam)；免疫組化試劑盒 (SABC)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司);光學倒置顯微鏡IX50型(Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔角膜緣組織取材 雄兔2.5 kg，采用耳緣靜脈空氣栓塞處死后，碘伏消毒眼周，置入開瞼器，PBS液沖洗結(jié)膜囊3次，無菌摘除眼球并剪除筋膜及眼肌，PBS反復沖洗后，浸泡于含雙抗的PBS溶液中，放置在4℃冰箱中30 min，將浸泡過的眼球組織置于無菌平皿中，在超凈工作臺內(nèi)操作，眼科鑷固定眼球，眼科剪取下2 mm×2 mm×1 mm淺層灰白色交界區(qū)角膜緣組織，放置于含PBS的EP管中。

1.2.2 細胞培養(yǎng)液的制備 基本培養(yǎng)基為DMEM/F12混合液(Gibco公司)，每45 mL DMEM/F12混合液中加入7.5 mL胎牛血清(Gibco公司)、500 μL青-鏈霉素混合液(Solarbio公司，雙抗液濃度為青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)、2 mmol/L L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸(NEA)，重組人表皮細胞生長因子(rhEGF，10 ng/mL)。

1.2.3 組織工程化角膜上皮的制備 在超凈工作臺中取出干燥保存的脫細胞豬角膜基質(zhì)6片，生理鹽水復水，于DMEM/F12混合液中浸泡2 h，前彈力層面向上鋪于6孔板孔底，干燥12 h，基質(zhì)片與6孔板孔底緊密貼合后，取約1 mm×1 mm大小兔角膜緣組織貼附于基質(zhì)片上，上皮面向下，3～4塊/孔，干燥1 h，加2～3滴含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，次日適量加液，以后隔2～3 d換液，培養(yǎng)15 d，倒置顯微鏡下每天觀察并記錄細胞生長情況。

1.2.4 組織工程化角膜上皮的移植 取雄兔5只，采用水合氯醛耳緣靜脈注射麻醉滿意后，隨機選擇一眼為手術(shù)眼，碘伏消毒眼周，置開瞼器，林格液沖洗結(jié)膜囊，用8 mm大小負壓環(huán)鉆于角膜中央鉆取150 μm深度板層角膜，取下角膜直徑8 mm、厚150 μm，板層刀修剪角膜植床，取培養(yǎng)14 d角膜上皮組織5片，用8.5 mm大小負壓環(huán)鉆鉆切同等大小植片，上皮面向上，10-0縫線連續(xù)縫合于角膜植床上，3-0尼龍線間斷縫合眼瞼中央兩針，術(shù)畢涂妥布霉素地塞米松眼膏，術(shù)后第2天拆除眼瞼縫線點抗生素及激素類滴眼液，以后左氧氟沙星滴眼液4次/d，妥布霉素地塞米松滴眼液3次/d，妥布霉素地塞米松眼膏1次/晚，隨訪的臨床檢查包括裂孔燈檢查以評估結(jié)膜充血、角膜光學清晰度、新生血管化和移植物退化等情況。

1.2.5 HE染色 取培養(yǎng)30 d后的組織工程化角膜組織1片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，100%乙醇洗去二甲苯；梯度乙醇水化；蘇木素、伊紅染色各10 min；根據(jù)顏色深淺用80%的乙醇分化，梯度乙醇脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min；在石蠟切片中央滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 免疫熒光化學染色 于組織工程角膜上皮移植術(shù)后30 d，采用空氣栓塞的方法處死實驗動物1只，取術(shù)眼角膜行免疫熒光化學染色；(1)60℃烤片12 h；(2)切片脫蠟：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次置于100%、95%、85%和75%乙醇中，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min；(3)熱修復抗原：將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮23 min后，冷卻23 min后拿出，冷卻至室溫。冷卻后0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.6)洗滌3 min×3次；(4)切片置于硼氫化鈉溶液中室溫下30 min，水漂洗5 min；(5)切片置于蘇丹黑染液中室溫下5 min，水沖洗3 min；(6)血清封閉液室溫封閉60 min；(7)孵育一抗：滴加適當稀釋的一抗(HMGB1)，4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次；(8)孵育二抗：滴加50～100 μL抗-兔-IgG標記熒光抗體，37℃孵育90 min，PBS沖洗5 min×3次；(9)DAPI工作液37℃染核10 min，PBS沖洗5 min×3次；(10)緩沖甘油封片;(11)避光保存，置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

2.1.1 組織工程化角膜上皮 倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，組織塊接種第1周時進展緩慢，只有幾個細胞出現(xiàn)在組織塊周圍，1周過后，細胞增殖狀態(tài)增強，細胞呈“沙灘樣”外觀從組織塊邊緣延伸出來，7～9 d后，逐漸形成細胞生長暈(圖1-A),10～12 d后，貼壁細胞達到70%～80%匯合，呈鋪路石狀(圖1-B)，15 d后，貼壁細胞逐漸形成單層，細胞形狀以多邊形和梭形為主(圖1-C)。

注：A：細胞生長7～9 d后，逐漸形成細胞生長暈(×4)；B：10～12 d后，貼壁細胞達到70%～80%匯合，呈鋪路石狀(×4)；C：15 d后，貼壁細胞逐漸形成單層，細胞形狀以多邊形和梭形為主(×10)

2.1.2 組織工程化角膜板層移植 手術(shù)完畢后，術(shù)眼角膜縫線規(guī)整，角膜邊緣平滑(圖2-A)；術(shù)后4 d對術(shù)眼進行裂隙燈顯微鏡拍照，植入眼的角膜稍渾濁，無新生血管，無嚴重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色鈷藍光下拍照顯示角膜大部分著染(圖2-B，圖2-C)；術(shù)后9 d對術(shù)眼進行裂隙燈顯微鏡拍照，植入眼的角膜下方稍渾濁，未見新生血管，無嚴重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色鈷藍光下拍照顯示角膜下方著染(圖2-D，圖2-E)；術(shù)后15 d對術(shù)眼進行裂隙燈顯微鏡拍照，角膜較前透明，沒有新生血管，熒光素染色鈷藍光下拍照顯示僅角膜縫線處著染，角膜4～5點位出現(xiàn)直徑約2 mm圓形缺損(圖2-F、2-G)；術(shù)后21 d對術(shù)眼進行裂隙燈顯微鏡拍照，植入眼的角膜透明，無新生血管，無結(jié)膜水腫和充血，角膜中央虹膜紋理清晰，熒光素染色鈷藍光下拍照顯示角膜僅縫線處著染，下方圓形缺損消失(圖2-H、2-I)。

2.2 HE染色 術(shù)后30 d HE染色光鏡下可見植入后的角膜組織與宿主角膜組織結(jié)合良好，膠原纖維排列規(guī)則，上皮細胞可見4～5層結(jié)構(gòu)，支架中見散在細胞，可見角膜緣干細胞多呈卵圓形，細胞核呈藍色，大部分為單核，細胞質(zhì)呈粉紅色至深紅色。見圖3。

2.3 免疫熒光染色 術(shù)后30 d免疫熒光染色光鏡下可見培養(yǎng)的細胞P63、CK3單克隆抗體呈陽性表達，CK3單克隆抗體染色呈紅色熒光，P63單克隆抗體染色呈綠色熒光，DAPI顯示細胞核呈藍色熒光。見圖4。

3 討論

國內(nèi)外研究顯示，角膜緣干細胞移植治療角膜緣干細胞缺乏的動物實驗中，可成功重建其眼表功能[12-13]。本實驗應(yīng)用脫細胞異種角膜基質(zhì)為支架，角膜緣干細胞為種子細胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮為供體，行同種異體板層角膜移植，術(shù)后4～5 d植片霧狀混濁，14～21 d左右植片透明。于術(shù)后1個月左右脫細胞豬角膜基質(zhì)細胞化，HE染色顯示植片和植床結(jié)合良好，上皮細胞可見4～5層結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色顯示角膜上皮組織中AE5、P63抗體均有表達，證實了這種組織工程化角膜上皮適合作板層移植的供體。

干細胞具有多能性和增殖再生能力，是具有更新能力的未分化細胞[14-15]。眾所周知，角膜干細胞位于角膜緣，在角膜上皮的基底層，角膜創(chuàng)傷愈合和更新都需要角膜緣干細胞的支持，Stevens-Johnson綜合征、慢性角膜炎、酸堿燒傷等造成LSCD的眼表疾病，都需要通過角膜緣干細胞的移植來重建眼表功能[16]。體外培養(yǎng)角膜緣干細胞的重要條件是獲得角膜緣組織。角膜緣處主要由基質(zhì)層和上皮層組成，角膜緣干細胞不斷增殖分化并向心性移動，成為角膜上皮細胞自我更新的源泉。目前研究表明，角膜緣干細胞的培養(yǎng)主要以組織塊法和酶消化法兩種培養(yǎng)方式為主[17]，酶消化法能把組織分散成單個細胞或細胞團，獲得高比例的細胞群[18]，但其吹打、離心等操作方式繁雜，易破壞細胞，酶消化時間的長短也較難把控，時間長易損害細胞，時間短較難分離出細胞[19]；本研究采用的是組織塊培養(yǎng)法，組織塊培養(yǎng)法是目前使用最廣泛的一種培養(yǎng)方式，其具有操作簡便的優(yōu)點，減少細胞污染的機會，且可以培養(yǎng)出具有體內(nèi)生物學特性的細胞。

注：A：術(shù)后當天：術(shù)眼角膜縫線規(guī)整，角膜邊緣平滑；B、C：術(shù)后4 d，無嚴重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色鈷藍光下拍照顯示角膜大部分著染。D、E：術(shù)后9 d，植入眼的角膜下方稍渾濁，未見新生血管，無嚴重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色顯示角膜下方著染；F、G：術(shù)后15 d，角膜較前透明，沒有新生血管，熒光素染色僅角膜縫線處著染，4～5點位出現(xiàn)直徑約2 mm圓形缺損。H、I：術(shù)后21 d，植入眼的角膜透明，角膜中央虹膜紋理清晰，熒光素染色鈷藍光下拍照顯示角膜僅縫線處著染角膜是眼球的第一道屏障，易受眼內(nèi)外各種有毒有害物質(zhì)的影響[20-21]，基質(zhì)前表面由4～5層上皮細胞組成的角膜上皮是角膜的第一防御屏障[22]，附于基質(zhì)后表面的內(nèi)皮由規(guī)則的內(nèi)皮細胞層形成，并具有脫水泵功能，以保持角膜的透明度[23]。角膜基質(zhì)是一種不可再生的組織，由約250～300層膠原層組成，由Ⅰ型膠原纖維組成[24]，它提供了角膜的大部分結(jié)構(gòu)框架，約占角膜厚度的80%～90%，角膜基質(zhì)中特殊的膠原網(wǎng)絡(luò)決定了角膜的穩(wěn)定性、機械強度和透明度[25-26]。因此，尋找一種具有良好生物相容性、高光學清晰度、抗手術(shù)韌性和組織工程角膜非免疫原性的理想支架是至關(guān)重要的。脫細胞豬角膜基質(zhì)(APCM)具有良好的光學清晰度、耐手術(shù)韌性和生物相容性。此外，APCM還支持細胞分化、增殖和遷移[27]，APCM保存了天然角膜基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，由Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等主要分子組成，對細胞的分化、增殖和遷移非常重要[28]。到目前為止，還沒有能夠完全模仿天然角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的人工支架。更重要的是，豬角膜有豐富的來源，比合成支架更容易獲得。用APCM研制一種含有上皮和部分基質(zhì)的前角膜替代物，來重建一個完整的、健康的、分層的上皮層來進行角膜移植以防御角膜感染是可行的。在本研究中，2～3層上皮細胞在APCM表面迅速形成，并在1個月內(nèi)形成緊密連接。APCM保存了天然角膜的結(jié)構(gòu)，包括能夠支持基質(zhì)細胞生長的孔隙和分子結(jié)構(gòu)[28]。

注：角膜組織與宿主角膜組織結(jié)合良好，膠原纖維排列規(guī)則，上皮細胞可見4～5層結(jié)構(gòu)，支架中見散在細胞，可見角膜緣干細胞多呈卵圓形，細胞核呈藍色，大部分為單核，細胞質(zhì)呈粉紅色至深紅色(A：×10；B：×20)

注：A：CK3單克隆抗體染色呈紅色熒光；B：P63單克隆抗體染色呈綠色熒光；C：DAPI顯示細胞核呈藍色

角膜的生物力學性能是角膜組織工程的關(guān)鍵因素。用APCM構(gòu)建的兔前角膜置換術(shù)具有抗縫線阻力等生物力學性能。在1個月的板層角膜移植期內(nèi)，所有植入的角膜均無主要并發(fā)癥，如基質(zhì)水腫、新生血管形成或炎癥等，植入角膜內(nèi)無排斥反應(yīng)或角膜擴張的癥狀。雖然在板層角膜移植早期，由于手術(shù)操作和緊固縫線造成角膜上皮缺損，但3周后正常角膜上皮迅速覆蓋移植表面。因此，今后應(yīng)采用一種改良的手術(shù)方法來改善這種情況。術(shù)后1個月，雖然角膜是透明的，但其表面似乎不規(guī)則，角膜有輕微的陰影，如果在臨床上使用，可能會降低患者的視力。在天然角膜基質(zhì)中，分布著靜止的基質(zhì)細胞，負責膠原纖維的調(diào)節(jié)和基質(zhì)透明性的維持。它們也被命名為角化細胞[29]。然而，隨著微環(huán)境的改變，如角膜損傷，會導致細胞凋亡或轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，從而使光線離散，產(chǎn)生角膜混濁，改變基質(zhì)中的膠原成分[30]。為了保證上皮細胞和基質(zhì)細胞在APCM中生長良好，采用血清進行培養(yǎng)，血清中含有復雜的生長因子，可將角化細胞轉(zhuǎn)化成成纖維細胞或肌成纖維細胞[31]。這可能是移植角膜中不規(guī)則的角膜表面或薄霧形成的原因。因此，要完善培養(yǎng)體系，解決這一問題，如使用無血清培養(yǎng)系統(tǒng)。盡管需要改進培養(yǎng)系統(tǒng)和手術(shù)技術(shù)以獲得最佳的視覺效果，但本研究中的結(jié)構(gòu)是透明的，同時顯示出良好的生物相容性、生物安全性和再生特性，使它們能夠作為人類角膜移植的有價值的替代物。雖然臨床上的研究還有待于進一步確定角膜替代物的全部潛能，以減輕供體角膜組織的缺乏，但我們的研究結(jié)果表明，當內(nèi)皮細胞不受損害時，所構(gòu)建的角膜替代物可能是LK或DLK等手術(shù)中替代人角膜組織的一種可能的選擇。