馮建英,楊 勇,嚴(yán)曉華,閆鮮鵬,衛(wèi) 麗,高 娜,賀 望,萬 萱,鄭千千,焦富勇
(陜西省人民醫(yī)院兒童病院,陜西 西安 710068)
川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種以全身血管炎性病變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)的急性發(fā)熱出疹性小兒疾病,冠狀動脈損傷(coronary artery lesions,CAL)是其主要并發(fā)癥,已經(jīng)成為兒童獲得性心臟病的最常見病因,其發(fā)病原因尚不清楚。大量臨床及流行病學(xué)研究資料顯示KD的發(fā)生與遺傳易感性密切相關(guān)[1-2];有研究發(fā)現(xiàn)PEAR1、MPO、FCGR2A及BLK等眾多免疫相關(guān)因子基因均為KD的重要遺傳易感基因[3-6]。樹突狀細(xì)胞特異性C凝集素(dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non integrin,DC-SIGN)是具有糖結(jié)合域的Ⅱ型跨膜蛋白,人DC-SIGN由CD209基因編碼,是樹突狀細(xì)胞表面重要的粘附分子受體,能夠介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞與初始T細(xì)胞聚集,識別和介導(dǎo)多種病原體在人體內(nèi)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生,在機(jī)體區(qū)域免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[7-8]。有證據(jù)表明CD209基因啟動子多態(tài)性與KD的易感性密切相關(guān)[9]。CD209基因高度多態(tài)性的特征及存在眾多的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[10],故為了進(jìn)一步研究CD209基因是否存在其它導(dǎo)致KD發(fā)病的候選SNP,本課題以中國陜西西安地區(qū)漢族兒童為研究對象,采用Long-PCR方法對CD209基因進(jìn)行全長測序,以分析CD209基因3′非翻譯區(qū)(3′untranslated,3′UTR)位點(diǎn)的多態(tài)性與兒童KD的遺傳易感性和CAL的關(guān)聯(lián)性。
選取2017年9月至2019年9月在陜西省人民醫(yī)院兒童病院住院的KD患兒40例(KD組),其中男25例,女15例,年齡為8個(gè)月至8歲,平均(3.39±1.77)歲。所有病例均符合KD國際診斷標(biāo)準(zhǔn)[11],所有患兒均在治療中進(jìn)行超聲心動圖檢測,根據(jù)是否合并CAL[11],將KD組分為CAL組(男9例,女5例)和非CAL(NCAL)組(男15例,女11例)。CAL的納入標(biāo)準(zhǔn):①<5歲者,內(nèi)徑絕對值≥3mm;②≥5歲者,內(nèi)徑絕對值≥4mm;③某段管徑為鄰近段的1.5倍及以上;④管壁明顯不規(guī)則。KD的排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其它自身免疫性疾病或者獲得性免疫缺陷病的患兒;②合并腫瘤的患兒;③合并先天性疾病的患兒;④有遺傳、代謝性疾病兒童;⑤合并腦癱、中樞協(xié)調(diào)障礙者。收集同期在陜西省人民醫(yī)院兒童病院健康體檢兒童40例納入對照組,其中男性20例,女性20例,年齡為10個(gè)月至8歲,平均(3.41±1.92)歲,既往均無KD病史,排除標(biāo)準(zhǔn)與KD組相同。兩組均為無血緣關(guān)系的陜西西安地區(qū)漢族人群,且在性別、年齡方面分布均無顯著性差異(均P>0.05)。所有研究對象入組均得到家長同意,并簽署知情同意書。研究項(xiàng)目得到陜西省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。
所有患兒在入院當(dāng)天抽取靜脈血2mL,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。
1.3.1 DNA的提取及PCR擴(kuò)增
使用邁基諾基因組DNA提取試劑盒對待測樣本進(jìn)行核酸提取,提取后的DNA使用Nanodrop 2000進(jìn)行質(zhì)檢。根據(jù)美國加州大學(xué)圣克魯茲分校(University of California Santa Cruz,UCSC)數(shù)據(jù)庫中人類基因組數(shù)據(jù)庫CD209基因(NM_021155)的參考基因序列(chr19:7804881-7812464),獲取從該基因的5′UTR上游的1 000bp,到3′UTR下游的1 000bp的序列,設(shè)計(jì)兩條引物序列,上游引物:5′-GGAGCCATGCCT GGTAGTTAT-3′,下游引物:5′-AATTCTTGAAAGATCCGGCCC-3′。使用Long-PCR方法,對CD209基因進(jìn)行長片段擴(kuò)增,獲得CD209基因片段,擴(kuò)增長度為8 396bp,并使用瓊脂糖凝膠電泳法對所得片段進(jìn)行質(zhì)檢。
PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為50μL:包含5xPrime STAR GXL Buffer(Takara公司)10μL,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL,gDNA(2.5ng/μL)2.5μL,2.5mmol/L dNTP Mixture(GENERAY BIOTECH公司)4μL,ddH2O為27.5μL,2.5μL模板和上下游引物(引物濃度均為4μmol/L)各2.5μL。兩步法PCR反應(yīng)條件:98℃ 10s 1個(gè)循環(huán);98℃ 10s,68℃ 9min共30個(gè)循環(huán);最后置于4℃保存。
1.3.2 PCR產(chǎn)物測序及分析
PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,合格樣本使用Gen Cap?二代測序快速DNA建庫試劑盒完成文庫的構(gòu)建。所得文庫經(jīng)Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢,并使用Illumina Nextseq 500測序儀進(jìn)行上機(jī)測序。對測序完成的數(shù)據(jù),使用GATK 4.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和拆分,并使用GATK的Haplotype Caller工具檢測SNP及插入缺失多態(tài)性位點(diǎn)(insertion and deletion,INDEL)。最后,數(shù)據(jù)經(jīng)Annovar(2018Apr16)軟件和邁基諾自編腳本對SNP和INDEL結(jié)果進(jìn)行注釋,關(guān)聯(lián)到多個(gè)數(shù)據(jù)庫,得到數(shù)據(jù)分型和數(shù)據(jù)信息。
本研究采用連鎖不平衡法進(jìn)行TagSNP的篩選。利用美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI)SNP數(shù)據(jù)庫下載中國南方漢族人群(CHS)和中國北京漢族人群(CHB)CD209基因的信息數(shù)據(jù)(GRCh37版本),再利用Haploview 4.2軟件選取TagSNP位點(diǎn)。在入選標(biāo)準(zhǔn)是連鎖不平衡參數(shù)D’=1,連鎖不平衡系數(shù)r2≥0.8,且最小等位基因頻率(minimum allele frequency,MAF)≥0.1的條件下,選取CD209基因3′UTR區(qū)的TagSNP位點(diǎn),最終目標(biāo)區(qū)域共有5個(gè)TagSNPs位點(diǎn)入選。各位點(diǎn)信息見表1。
表1 CD209基因各位點(diǎn)信息
按PCR反應(yīng)體系及條件,使用Long-PCR方法,對CD209基因進(jìn)行長片段擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)片段長度為8 396bp,擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,以15 000DNA marker(Trans Gen Biotech)作為對照,PCR產(chǎn)物條帶位于7 000~10 000bp之間,提示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為CD209基因,條帶熒光亮度較強(qiáng),且附近無其他條帶,符合實(shí)驗(yàn)要求,表明其濃度與純度可達(dá)直接測序的要求,見圖1。
測序結(jié)果表明,引物可覆蓋CD209基因全部區(qū)域,且覆蓋度可達(dá)到100%,所有研究對象的基因組DNA中均檢測到CD209基因5個(gè)目標(biāo)TagSNPs位點(diǎn),可以滿足測試要求。部分KD患兒樣本rs4804800G/A位點(diǎn)(chr19-7805128)分型測序圖見圖2、圖3、圖4。
注:M為15 000 DNA Marker,1和2分別代表2個(gè)待測CD209基因DNA樣本。
在所檢驗(yàn)的對照組樣本中,CD209基因5個(gè)TagSNPs的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05),具有群體代表性,如表2。
表2 對照組Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果
圖2 19C069334標(biāo)本rs4804800G/A位點(diǎn)測序圖(GG基因型)
圖3 17C056843標(biāo)本rs4804800G/A位點(diǎn)測序圖(AA基因型)
圖4 19C048007標(biāo)本rs4804800G/A位點(diǎn)測序圖(GA基因型)
2.4.1各TagSNPs等位基因與兒童KD易感性的關(guān)聯(lián)分析
KD組CD209基因rs4804800位點(diǎn)G等位基因分布頻率顯著高于對照組(χ2=3.906、OR=2.323,均P<0.05),該位點(diǎn)攜帶G等位基因的患兒發(fā)生KD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,提示rs4804800位點(diǎn)G等位基因可能為兒童KD的風(fēng)險(xiǎn)等位基因;KD組CD209基因rs11465421位點(diǎn)T等位基因分布頻率顯著高于對照組(χ2=4.103、OR=2.333,均P<0.05),攜帶T等位基因兒童發(fā)生KD的風(fēng)險(xiǎn)比攜帶G等位基因者增加2.333倍,提示rs11465421位點(diǎn)T等位基因可能為KD的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。KD組其余位點(diǎn)等位基因頻率與對照組間分布均無顯著性差異(均P>0.05)。
2.4.2各TagSNPs基因型與兒童KD易感性的關(guān)聯(lián)分析
KD組CD209基因rs4804800位點(diǎn)基因型分布頻率與對照組間有顯著性差異(χ2=4.528、OR=2.818,均P<0.05),該位點(diǎn)攜帶G等位基因的基因型(G/A-G/G)較AA基因型發(fā)生KD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,考慮該位點(diǎn)攜帶G等位基因的基因型可能為兒童KD的風(fēng)險(xiǎn)基因型;KD組CD209基因rs11465421位點(diǎn)基因型分布頻率與對照組間同樣有顯著性差異(χ2=4.381、OR=2.714,均P<0.05),該位點(diǎn)攜帶T等位基因的基因型(G/T-T/T)較GG基因型發(fā)生KD的風(fēng)險(xiǎn)增加2.714倍,為兒童KD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)基因型,提示rs4804800與rs11465421位點(diǎn)多態(tài)性與兒童KD的易感性關(guān)聯(lián)。KD組其余位點(diǎn)基因型頻率與對照組間分布均無顯著性差異(均P>0.05)。
2.4.3各TagSNPs與兒童KD并發(fā)CAL易感性的關(guān)聯(lián)分析
CAL組與NCAL組間各位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布均無顯著性差異(均P>0.05),提示CD209基因各位點(diǎn)多態(tài)性與兒童KD并發(fā)CAL無關(guān)聯(lián)。
CD209基因的5個(gè)TagSNPs等位基因及基因型分布頻率在KD組與對照組及CAL組與NCAL組之間對比結(jié)果見表3。
表3 CD209基因各標(biāo)簽位點(diǎn)多態(tài)性與兒童KD及并發(fā)CAL易感性的關(guān)聯(lián)分析(n)
DC-SIGN是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的樹突狀細(xì)胞跨膜凝集素受體,除了具有細(xì)胞粘附和識別病原體的功能外,還可以誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)途徑,尤其是在與Toll樣受體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑共激活時(shí)發(fā)揮作用,具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能[12-13]。人DC-SIGN由CD209基因編碼,位于染色體19p13.2~13.3區(qū),目前對CD209基因多態(tài)性與疾病的研究多集中于啟動子區(qū)rs4804803位點(diǎn)上。Chaaithanya等[14]研究提示CD209基因啟動子rs4804803 GG基因型與基孔肯雅熱的易感性及感染患者的病情發(fā)展相關(guān)。Ren等[15]研究認(rèn)為,CD209基因啟動子rs4804803位點(diǎn)G等位基因與登革熱感染患者的易感性及嚴(yán)重度密切相關(guān)。Chan等[16]研究發(fā)現(xiàn),CD209基因啟動子區(qū)rs4804803位點(diǎn)多態(tài)性與CD209基因分子的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián),CD209基因rs4804803G啟動子具有較低的有效結(jié)合位點(diǎn)和啟動子活性,導(dǎo)致rs4804803位點(diǎn)攜帶G等位基因的中國SARS患者CD209基因蛋白表達(dá)下降,感染過程中免疫反應(yīng)降低,肺損傷減少,同時(shí)反映SARS感染嚴(yán)重程度及預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)乳酸脫氫酶水平的升高風(fēng)險(xiǎn)顯著降低??梢?,CD209基因多態(tài)性在感染及炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。
CD209基因多態(tài)性與KD的易感性密切關(guān)聯(lián)。Yu等[9]的一項(xiàng)病例對照研究發(fā)現(xiàn),中國臺灣地區(qū)人群CD209基因啟動子區(qū)rs4804803位點(diǎn)的多態(tài)性與KD的發(fā)生密切相關(guān),該位點(diǎn)的G等位基因是KD發(fā)生的危險(xiǎn)等位基因,但與丙種球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)耐藥及CAL的形成無關(guān)。Kuo等[17]的研究顯示,CD209基因的3′UTR區(qū)rs4804800位點(diǎn)的多態(tài)性與中國臺灣地區(qū)人群KD風(fēng)險(xiǎn)間也存在顯著相關(guān)性,但未發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與CAL形成及IVIG治療反應(yīng)有任何關(guān)聯(lián)。由于CD209基因具有高度多態(tài)性的特征并存在眾多的SNP,因此,有必要進(jìn)一步研究CD209基因是否存在其它致KD發(fā)病的候選SNP。本研究對CD209基因3′UTR區(qū)的5個(gè)TagSNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn),陜西人群CD209基因3′UTR區(qū)rs4804800和rs11465421位點(diǎn)的多態(tài)性與KD兒童的易感性顯著關(guān)聯(lián),但同樣未發(fā)現(xiàn)該基因的遺傳變異與KD患兒CAL形成相關(guān)聯(lián),與上述研究結(jié)果一致。CD209基因在3′UTR有多個(gè)多態(tài)位點(diǎn),目前認(rèn)為3′UTR區(qū)域?yàn)閙iRNA的靶向結(jié)合區(qū),與mRNA的穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)相關(guān),該區(qū)域發(fā)生的變異可能會影響miRNA調(diào)控作用及靶基因的表達(dá)[18],故而推測該區(qū)域位點(diǎn)多態(tài)性可能會影響CD209基因分子的表達(dá)及MAPK通路的活性,進(jìn)而參與了兒童KD形成的病理改變過程。在目前對SNP的研究中,由于缺乏相關(guān)基因位點(diǎn)的功能性研究,CD209基因的3′UTR區(qū)的作用尚不明確,但在KD中CD209基因的異常表達(dá)可能會影響疾病的進(jìn)展及預(yù)后。雖然本研究中CD209基因3′UTR多態(tài)性與KD患兒CAL的風(fēng)險(xiǎn)缺乏聯(lián)系,但是這些數(shù)據(jù)亦不能排除CD209基因在KD進(jìn)展中的病理生理學(xué)作用。
綜上所述,本課題結(jié)果顯示,CD209基因多態(tài)性與陜西西安地區(qū)兒童KD的易感性有關(guān),但與CAL的發(fā)生無關(guān)。CD209基因多態(tài)性在炎癥信號傳導(dǎo)和KD發(fā)展中的作用尚不清楚,需要進(jìn)一步進(jìn)行功能性研究來驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。本研究的樣本量相對較小,可能會導(dǎo)致一些微效基因出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的遺漏,還需要后續(xù)進(jìn)行更大樣本的研究驗(yàn)證。