CD209基因3′非翻譯區(qū)多態(tài)性與川崎病的關(guān)聯(lián)性研究

馮建英，楊 勇，嚴曉華，閆鮮鵬，衛(wèi) 麗，高 娜，賀 望，萬 萱，鄭千千，焦富勇

(陜西省人民醫(yī)院兒童病院，陜西 西安 710068)

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種以全身血管炎性病變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)的急性發(fā)熱出疹性小兒疾病，冠狀動脈損傷(coronary artery lesions，CAL)是其主要并發(fā)癥，已經(jīng)成為兒童獲得性心臟病的最常見病因，其發(fā)病原因尚不清楚。大量臨床及流行病學(xué)研究資料顯示KD的發(fā)生與遺傳易感性密切相關(guān)[1-2]；有研究發(fā)現(xiàn)PEAR1、MPO、FCGR2A及BLK等眾多免疫相關(guān)因子基因均為KD的重要遺傳易感基因[3-6]。樹突狀細胞特異性C凝集素(dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non integrin，DC-SIGN)是具有糖結(jié)合域的Ⅱ型跨膜蛋白，人DC-SIGN由CD209基因編碼，是樹突狀細胞表面重要的粘附分子受體，能夠介導(dǎo)樹突狀細胞與初始T細胞聚集，識別和介導(dǎo)多種病原體在人體內(nèi)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生，在機體區(qū)域免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[7-8]。有證據(jù)表明CD209基因啟動子多態(tài)性與KD的易感性密切相關(guān)[9]。CD209基因高度多態(tài)性的特征及存在眾多的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)[10]，故為了進一步研究CD209基因是否存在其它導(dǎo)致KD發(fā)病的候選SNP，本課題以中國陜西西安地區(qū)漢族兒童為研究對象，采用Long-PCR方法對CD209基因進行全長測序，以分析CD209基因3′非翻譯區(qū)(3′untranslated，3′UTR)位點的多態(tài)性與兒童KD的遺傳易感性和CAL的關(guān)聯(lián)性。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年9月至2019年9月在陜西省人民醫(yī)院兒童病院住院的KD患兒40例(KD組)，其中男25例，女15例，年齡為8個月至8歲，平均(3.39±1.77)歲。所有病例均符合KD國際診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，所有患兒均在治療中進行超聲心動圖檢測，根據(jù)是否合并CAL[11]，將KD組分為CAL組(男9例，女5例)和非CAL(NCAL)組(男15例，女11例)。CAL的納入標(biāo)準(zhǔn)：①<5歲者，內(nèi)徑絕對值≥3mm；②≥5歲者，內(nèi)徑絕對值≥4mm；③某段管徑為鄰近段的1.5倍及以上；④管壁明顯不規(guī)則。KD的排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它自身免疫性疾病或者獲得性免疫缺陷病的患兒；②合并腫瘤的患兒；③合并先天性疾病的患兒；④有遺傳、代謝性疾病兒童；⑤合并腦癱、中樞協(xié)調(diào)障礙者。收集同期在陜西省人民醫(yī)院兒童病院健康體檢兒童40例納入對照組，其中男性20例，女性20例，年齡為10個月至8歲，平均(3.41±1.92)歲，既往均無KD病史，排除標(biāo)準(zhǔn)與KD組相同。兩組均為無血緣關(guān)系的陜西西安地區(qū)漢族人群，且在性別、年齡方面分布均無顯著性差異(均P>0.05)。所有研究對象入組均得到家長同意，并簽署知情同意書。研究項目得到陜西省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2血液標(biāo)本的收集

所有患兒在入院當(dāng)天抽取靜脈血2mL，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

1.3實驗方法

1.3.1 DNA的提取及PCR擴增

使用邁基諾基因組DNA提取試劑盒對待測樣本進行核酸提取，提取后的DNA使用Nanodrop 2000進行質(zhì)檢。根據(jù)美國加州大學(xué)圣克魯茲分校(University of California Santa Cruz，UCSC)數(shù)據(jù)庫中人類基因組數(shù)據(jù)庫CD209基因(NM_021155)的參考基因序列(chr19:7804881-7812464)，獲取從該基因的5′UTR上游的1 000bp，到3′UTR下游的1 000bp的序列，設(shè)計兩條引物序列，上游引物：5′-GGAGCCATGCCT GGTAGTTAT-3′，下游引物：5′-AATTCTTGAAAGATCCGGCCC-3′。使用Long-PCR方法，對CD209基因進行長片段擴增，獲得CD209基因片段，擴增長度為8 396bp，并使用瓊脂糖凝膠電泳法對所得片段進行質(zhì)檢。

PCR擴增總反應(yīng)體系為50μL：包含5xPrime STAR GXL Buffer(Takara公司)10μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，gDNA(2.5ng/μL)2.5μL，2.5mmol/L dNTP Mixture(GENERAY BIOTECH公司)4μL，ddH2O為27.5μL，2.5μL模板和上下游引物(引物濃度均為4μmol/L)各2.5μL。兩步法PCR反應(yīng)條件：98℃ 10s 1個循環(huán)；98℃ 10s，68℃ 9min共30個循環(huán)；最后置于4℃保存。

1.3.2 PCR產(chǎn)物測序及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，合格樣本使用Gen Cap?二代測序快速DNA建庫試劑盒完成文庫的構(gòu)建。所得文庫經(jīng)Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，并使用Illumina Nextseq 500測序儀進行上機測序。對測序完成的數(shù)據(jù)，使用GATK 4.0軟件對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理和拆分，并使用GATK的Haplotype Caller工具檢測SNP及插入缺失多態(tài)性位點(insertion and deletion，INDEL)。最后，數(shù)據(jù)經(jīng)Annovar(2018Apr16)軟件和邁基諾自編腳本對SNP和INDEL結(jié)果進行注釋，關(guān)聯(lián)到多個數(shù)據(jù)庫，得到數(shù)據(jù)分型和數(shù)據(jù)信息。

1.4 CD209基因3′UTR區(qū)TagSNP的選取

本研究采用連鎖不平衡法進行TagSNP的篩選。利用美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI)SNP數(shù)據(jù)庫下載中國南方漢族人群(CHS)和中國北京漢族人群(CHB)CD209基因的信息數(shù)據(jù)(GRCh37版本)，再利用Haploview 4.2軟件選取TagSNP位點。在入選標(biāo)準(zhǔn)是連鎖不平衡參數(shù)D’=1，連鎖不平衡系數(shù)r2≥0.8，且最小等位基因頻率(minimum allele frequency，MAF)≥0.1的條件下，選取CD209基因3′UTR區(qū)的TagSNP位點，最終目標(biāo)區(qū)域共有5個TagSNPs位點入選。各位點信息見表1。

表1 CD209基因各位點信息

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

按PCR反應(yīng)體系及條件，使用Long-PCR方法，對CD209基因進行長片段擴增，擴增產(chǎn)物目標(biāo)片段長度為8 396bp，擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以15 000DNA marker(Trans Gen Biotech)作為對照，PCR產(chǎn)物條帶位于7 000～10 000bp之間，提示PCR擴增產(chǎn)物為CD209基因，條帶熒光亮度較強，且附近無其他條帶，符合實驗要求，表明其濃度與純度可達直接測序的要求，見圖1。

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

測序結(jié)果表明，引物可覆蓋CD209基因全部區(qū)域，且覆蓋度可達到100%，所有研究對象的基因組DNA中均檢測到CD209基因5個目標(biāo)TagSNPs位點，可以滿足測試要求。部分KD患兒樣本rs4804800G/A位點(chr19-7805128)分型測序圖見圖2、圖3、圖4。

注：M為15 000 DNA Marker，1和2分別代表2個待測CD209基因DNA樣本。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗

在所檢驗的對照組樣本中，CD209基因5個TagSNPs的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)，具有群體代表性，如表2。

表2 對照組Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果

圖2 19C069334標(biāo)本rs4804800G/A位點測序圖(GG基因型)

圖3 17C056843標(biāo)本rs4804800G/A位點測序圖(AA基因型)

圖4 19C048007標(biāo)本rs4804800G/A位點測序圖(GA基因型)

2.4 CD209基因多態(tài)性與兒童KD及CAL的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1各TagSNPs等位基因與兒童KD易感性的關(guān)聯(lián)分析

KD組CD209基因rs4804800位點G等位基因分布頻率顯著高于對照組(χ2=3.906、OR=2.323，均P<0.05)，該位點攜帶G等位基因的患兒發(fā)生KD的風(fēng)險顯著增加，提示rs4804800位點G等位基因可能為兒童KD的風(fēng)險等位基因；KD組CD209基因rs11465421位點T等位基因分布頻率顯著高于對照組(χ2=4.103、OR=2.333，均P<0.05)，攜帶T等位基因兒童發(fā)生KD的風(fēng)險比攜帶G等位基因者增加2.333倍，提示rs11465421位點T等位基因可能為KD的風(fēng)險等位基因。KD組其余位點等位基因頻率與對照組間分布均無顯著性差異(均P>0.05)。

2.4.2各TagSNPs基因型與兒童KD易感性的關(guān)聯(lián)分析

KD組CD209基因rs4804800位點基因型分布頻率與對照組間有顯著性差異(χ2=4.528、OR=2.818，均P<0.05)，該位點攜帶G等位基因的基因型(G/A-G/G)較AA基因型發(fā)生KD的風(fēng)險顯著增加，考慮該位點攜帶G等位基因的基因型可能為兒童KD的風(fēng)險基因型；KD組CD209基因rs11465421位點基因型分布頻率與對照組間同樣有顯著性差異(χ2=4.381、OR=2.714，均P<0.05)，該位點攜帶T等位基因的基因型(G/T-T/T)較GG基因型發(fā)生KD的風(fēng)險增加2.714倍，為兒童KD發(fā)病的風(fēng)險基因型，提示rs4804800與rs11465421位點多態(tài)性與兒童KD的易感性關(guān)聯(lián)。KD組其余位點基因型頻率與對照組間分布均無顯著性差異(均P>0.05)。

2.4.3各TagSNPs與兒童KD并發(fā)CAL易感性的關(guān)聯(lián)分析

CAL組與NCAL組間各位點等位基因及基因型頻率分布均無顯著性差異(均P>0.05)，提示CD209基因各位點多態(tài)性與兒童KD并發(fā)CAL無關(guān)聯(lián)。

CD209基因的5個TagSNPs等位基因及基因型分布頻率在KD組與對照組及CAL組與NCAL組之間對比結(jié)果見表3。

表3 CD209基因各標(biāo)簽位點多態(tài)性與兒童KD及并發(fā)CAL易感性的關(guān)聯(lián)分析(n)

3討論

3.1 CD209基因多態(tài)性在炎性疾病免疫調(diào)節(jié)中的作用

DC-SIGN是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的樹突狀細胞跨膜凝集素受體，除了具有細胞粘附和識別病原體的功能外，還可以誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)途徑，尤其是在與Toll樣受體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑共激活時發(fā)揮作用，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能[12-13]。人DC-SIGN由CD209基因編碼，位于染色體19p13.2～13.3區(qū)，目前對CD209基因多態(tài)性與疾病的研究多集中于啟動子區(qū)rs4804803位點上。Chaaithanya等[14]研究提示CD209基因啟動子rs4804803 GG基因型與基孔肯雅熱的易感性及感染患者的病情發(fā)展相關(guān)。Ren等[15]研究認為，CD209基因啟動子rs4804803位點G等位基因與登革熱感染患者的易感性及嚴重度密切相關(guān)。Chan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CD209基因啟動子區(qū)rs4804803位點多態(tài)性與CD209基因分子的表達水平相關(guān)聯(lián)，CD209基因rs4804803G啟動子具有較低的有效結(jié)合位點和啟動子活性，導(dǎo)致rs4804803位點攜帶G等位基因的中國SARS患者CD209基因蛋白表達下降，感染過程中免疫反應(yīng)降低，肺損傷減少，同時反映SARS感染嚴重程度及預(yù)后的獨立指標(biāo)乳酸脫氫酶水平的升高風(fēng)險顯著降低?？梢?，CD209基因多態(tài)性在感染及炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。

3.2 CD209基因多態(tài)性與KD的關(guān)聯(lián)性

CD209基因多態(tài)性與KD的易感性密切關(guān)聯(lián)。Yu等[9]的一項病例對照研究發(fā)現(xiàn)，中國臺灣地區(qū)人群CD209基因啟動子區(qū)rs4804803位點的多態(tài)性與KD的發(fā)生密切相關(guān)，該位點的G等位基因是KD發(fā)生的危險等位基因，但與丙種球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)耐藥及CAL的形成無關(guān)。Kuo等[17]的研究顯示，CD209基因的3′UTR區(qū)rs4804800位點的多態(tài)性與中國臺灣地區(qū)人群KD風(fēng)險間也存在顯著相關(guān)性，但未發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與CAL形成及IVIG治療反應(yīng)有任何關(guān)聯(lián)。由于CD209基因具有高度多態(tài)性的特征并存在眾多的SNP，因此，有必要進一步研究CD209基因是否存在其它致KD發(fā)病的候選SNP。本研究對CD209基因3′UTR區(qū)的5個TagSNP進行關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)，陜西人群CD209基因3′UTR區(qū)rs4804800和rs11465421位點的多態(tài)性與KD兒童的易感性顯著關(guān)聯(lián)，但同樣未發(fā)現(xiàn)該基因的遺傳變異與KD患兒CAL形成相關(guān)聯(lián)，與上述研究結(jié)果一致。CD209基因在3′UTR有多個多態(tài)位點，目前認為3′UTR區(qū)域為miRNA的靶向結(jié)合區(qū)，與mRNA的穩(wěn)定性和蛋白表達相關(guān)，該區(qū)域發(fā)生的變異可能會影響miRNA調(diào)控作用及靶基因的表達[18]，故而推測該區(qū)域位點多態(tài)性可能會影響CD209基因分子的表達及MAPK通路的活性，進而參與了兒童KD形成的病理改變過程。在目前對SNP的研究中，由于缺乏相關(guān)基因位點的功能性研究，CD209基因的3′UTR區(qū)的作用尚不明確，但在KD中CD209基因的異常表達可能會影響疾病的進展及預(yù)后。雖然本研究中CD209基因3′UTR多態(tài)性與KD患兒CAL的風(fēng)險缺乏聯(lián)系，但是這些數(shù)據(jù)亦不能排除CD209基因在KD進展中的病理生理學(xué)作用。

綜上所述，本課題結(jié)果顯示，CD209基因多態(tài)性與陜西西安地區(qū)兒童KD的易感性有關(guān)，但與CAL的發(fā)生無關(guān)。CD209基因多態(tài)性在炎癥信號傳導(dǎo)和KD發(fā)展中的作用尚不清楚，需要進一步進行功能性研究來驗證這些發(fā)現(xiàn)。本研究的樣本量相對較小，可能會導(dǎo)致一些微效基因出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的遺漏，還需要后續(xù)進行更大樣本的研究驗證。