裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體的分離及鑒定

馮 延，武文卿，張靜遠，李 煜，李壘辰，袁 征，崔淑芳#

（1. 海軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物學教研室，上海 200433；2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，北京 100071）

外泌體（exosomes）具有脂質(zhì)雙分子層，密度在1.07～1.18 g/mL[1]，直徑在30～150 nm[2]，是一種起源于內(nèi)吞途徑的細胞外囊泡。多囊泡體（multivesicular body，MVB）與質(zhì)膜融合并排泄到細胞外微環(huán)境中，外泌體便由MVB產(chǎn)生[3]。外泌體可由體內(nèi)各種活細胞分泌，普遍存在于不同的細胞類型中，包括B細胞、樹突狀細胞、T細胞和血小板等，也存在于多種體液中，包括血清、唾液、尿液、母乳、腹水和腦脊髓液等[1]。外泌體還被認為是生物醫(yī)學研究中新興的新型治療靶標[4]。不同細胞來源的外泌體具有不同的功能，可以作為疾病診斷的生物標志物[5-6]。外泌體的納米級大小也使其成為開發(fā)藥物輸送系統(tǒng)的理想候選者，該系統(tǒng)可以將有效載荷輸送到目標組織、細胞和器官。已有多項研究支持外泌體可以在細胞之間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等特定成分，具有介導(dǎo)細胞間信號傳遞的重要功能[4-5]，并參與細胞中許多物理和病理的整合過程[7-9]。

裸鼴鼠具有多種獨特的生物學特性，如抗腫瘤、抗衰老、耐低氧及耐疼痛等。自發(fā)現(xiàn)這些特性以來，裸鼴鼠受到生物醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，越來越多地被應(yīng)用于生物醫(yī)學研究，尤其是在腫瘤、衰老、心血管等老年性疾病的研究中有著更好的優(yōu)勢。外泌體最早被發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中[10]，隨后在小鼠、大鼠等動物以及人體中也證實了其廣泛存在，但是目前國際上還沒有關(guān)于裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體研究的相關(guān)報道。本研究分離培養(yǎng)了裸鼴鼠的皮膚成纖維細胞，對其是否分泌外泌體進行分離及鑒定，為進一步研究裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體在生物過程中的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生裸鼴鼠由海軍軍醫(yī)大學實驗動物學教研室繁殖，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 儀器與試劑

主要儀器有：三氣培養(yǎng)箱（新加坡，Esco）、低溫高速離心機（德國，Eppendorf）、垂直電泳儀（美國，Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（中國，天能）、倒置熒光顯微鏡（德國，Leica）、透射電子顯微鏡（美國，Delong Instruments）、納米流式分析儀（中國，NanoFCM）、超高速低溫離心機（美國，Beckman）。

主要試劑有：DMEM（低糖）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素均購自美國Gibco公司；小鼠抗波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體（10366-1-AP）購自美國Proteintech公司；兔抗Vimentin (D21H3) XP單克隆抗體（5741S）購自美國CellSignaling Technology公司；小鼠抗CD63單克隆抗體（ab217345）、小鼠抗腫瘤易感基因101（TSG101）單克隆抗體（ab125011）、小鼠抗熱休克蛋白70（Hsp70）單克隆抗體（ab181606）購自英國Abcam公司；山羊抗小鼠抗體（A-11001）購自美國Invitrogen公司；山羊抗兔抗體購自美國Proteintech公司；去外泌體血清（EXO-FBS-50A-1）購自美國System Biosciences公司；抗熒光淬滅封片劑（P0131）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng) 無菌取新生裸鼴鼠背部皮膚，置于含1%青霉素/鏈霉素的PBS中漂洗3次，將其剪碎至1～2 mm2大小，用3 mL 0.25%的胰蛋白酶消化40 min。使用無菌鑷子或槍頭將組織塊盡量平貼于細胞培養(yǎng)皿中，每皿鋪4～6塊，置于37 ℃溫箱中30 min使組織塊貼緊于培養(yǎng)皿壁，沿邊緣輕柔加入含20% FBS、1% 青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍長出的細胞融合度至90%左右時，加入PBS洗去殘余的培養(yǎng)液，使用0.25%胰蛋白酶消化。一半細胞變圓后以5～6倍體積的含20%FBS的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打成單個細胞，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，此時的細胞記為第一代（P1代）細胞。每2～3 d換一次培養(yǎng)液，待P1代細胞長滿瓶底后，進行傳代培養(yǎng)，細胞傳至P3代起進行鑒定。

1.3.2 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞的免疫熒光鑒定 將P3代細胞以1×106個/mL接種于48孔板，待融合度至80%左右時，用PBS沖洗細胞2次，加入4%多聚甲醛溶液固定15 min，隨后用PBS洗3次；0.4%TritonX-100的PBS處理5 min，PBS洗3次，加入6%的BSA，置于37 ℃封閉0.5 h，吸棄上清液。加入1%BSA稀釋的小鼠抗Vimentin多克隆一抗（1∶100），4 ℃濕盒中避光孵育過夜；Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）洗滌3次，加入1%BSA稀釋的山羊抗小鼠二抗（1∶1 000），37 ℃孵育0.5 h，TBS洗滌3次后加入抗熒光淬滅封片劑（含DAPI），4℃保存以備鏡下觀察。

1.3.3 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞的蛋白質(zhì)印跡法鑒定 收集細胞培養(yǎng)瓶中的P3代細胞，使用RIPA裂解液充分進行裂解后，加入蛋白上樣緩沖液加熱變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4℃封閉過夜，依次加入兔抗Vimentin單克隆一抗（1∶1 000）、山羊抗兔二抗（1∶10000）進行孵育，使用ECL化學發(fā)光試劑進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測Vimentin表達情況。

1.4 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體的分離與鑒定

1.4.1 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體的分離 P4代細胞融合度為80%左右時，用PBS潤洗細胞2次，加入含20%去外泌體血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，48 h后收集細胞上清液80 mL，4℃，300×g離心10min，取上清液；2 000×g離心10 min，取上清液；10 000×g離心30 min，取上清液；100 000×g離心70 min，取沉淀，加入PBS洗滌，100 000×g離心70 min，取沉淀，用200 μL PBS重懸，—80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài) 將外泌體與等量的4%多聚甲醛溶液混合，將5～10 μL懸液滴加到封口膜上，將銅網(wǎng)Formvar膜面朝下放在懸液上，準備2～3個銅網(wǎng)，將100 μL PBS加到封口膜上，用鑷子將銅網(wǎng)（Formvar膜面朝下）放在PBS液滴上清洗；將銅網(wǎng)放在50 μL 1%戊二醛液滴上5 min，放在100 μL ddH2O中2min（洗8次），將外泌體固定在銅網(wǎng)上。對外泌體進行負染色處理，80kV下拍攝電鏡照片。

1.4.3 納米流式分析顆粒直徑 使用納米流式分析儀進行分析檢測，在相同的儀器條件下測試待檢樣品，并用PBS作為實驗空白對照，進行數(shù)據(jù)分析，獲得樣本粒徑分布圖。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測外泌體相關(guān)特異性蛋白表達 將分離得到的外泌體樣品加入等體積的外泌體專用裂解液，冰上充分裂解10 min，加入蛋白上樣緩沖液加熱變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入兔抗CD63、TSG101、Hsp70一抗（1∶1000）和山羊抗兔二抗（1∶10000）進行孵育，使用ECL化學發(fā)光試劑進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測CD63、TSG101和Hsp70表達情況。

2 結(jié)果

2.1 皮膚成纖維細胞形態(tài)學觀察

取新生裸鼴鼠背部皮膚，剪碎后鋪于細胞培養(yǎng)皿，第30小時可見組織塊邊緣有細胞游出（圖1A），第5天從組織塊游離出的細胞明顯增加（圖1B）。圖1C和圖1D分別為首次傳代后成纖維細胞和第3代成纖維細胞，細胞呈長梭形或多角形，狀態(tài)良好。

圖 1 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞顯微圖像（×100）Figure 1 Microscopic images of skin fibroblasts of naked mole rats (×100)

2.2 細胞免疫熒光

選取P3代皮膚成纖維細胞，鋪于48孔板進行免疫熒光鑒定，白光對照圖中成纖維細胞呈長梭形（圖2A）；免疫熒光圖片中綠色熒光為皮膚成纖維細胞中的波形蛋白，藍色為DAPI著色的細胞核（圖2B）。細胞純度在90%以上。

圖 2 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞免疫熒光鑒定（×200）Figure 2 Immunofluorescence identification of skin fibroblasts of naked mole rats （× 200）

2.3 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞中波形蛋白表達

采用波形蛋白單克隆抗體以蛋白質(zhì)印跡法檢測分離培養(yǎng)的P3代裸鼴鼠成纖維細胞中波形蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠成纖維細胞表達波形蛋白（圖3），從而證實分離的細胞具有成纖維細胞的特性。

2.4 外泌體形態(tài)觀察

透射電子顯微鏡下觀察，可見膜狀的杯托樣結(jié)構(gòu)（圖4），符合外泌體結(jié)構(gòu)特征。

圖 3 蛋白質(zhì)印跡法檢測裸鼴鼠皮膚成纖維細胞中波形蛋白表達Figure 3 Western blotting results of vimentin in skin fibroblasts of naked mole rats

圖 4 透射電子顯微鏡觀察裸鼴鼠皮膚成纖維細胞來源外泌體Figure 4 Transmission electron microscope observation on the exosomes derived from skin fibroblasts of naked mole rats

2.5 外泌體粒徑大小

納米流式分析結(jié)果顯示，分離獲得的外泌體粒徑大小分布在46.75～206.75 nm，其中大部分分布在30～150nm（圖5），符合外泌體標準粒徑范圍。

2.6 外泌體相關(guān)特異性蛋白表達

表面標志物的表達是驗證外泌體的特征之一，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測分離樣品，結(jié)果證實表面富含外泌體標志物CD63、TSG101和Hsp70蛋白（圖6）。

圖 5 裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體粒徑大小檢測Figure 5 Particles size analysis of exosomes of skin fibroblasts of naked mole rats

圖 6 蛋白質(zhì)印跡法檢測裸鼴鼠皮膚成纖維細胞外泌體Figure 6 Western blotting results of exosomes isolated from skin fibroblasts in naked mole rats

3 討論

與大小鼠等其他嚙齒類實驗動物相比，裸鼴鼠具有多種獨特的生物學特性，裸鼴鼠的成纖維細胞也具有一定特性，如能分泌超高分子量的透明質(zhì)酸。人類成纖維細胞分泌的透明質(zhì)酸相對分子量可達2×106，而成年裸鼴鼠的成纖維細胞產(chǎn)生的透明質(zhì)酸相對分子量可達6×106～12×106[11]。研究表明，這種超高分子量的透明質(zhì)酸相較于高分子量的透明質(zhì)酸，具有更好的細胞保護性能，不僅能保護裸鼴鼠細胞，還可以保護小鼠和人類細胞免受壓力誘導(dǎo)的細胞周期停滯和細胞死亡的影響，顯示了良好的抗衰老特性[12]。本研究為探索裸鼴鼠成纖維細胞是否產(chǎn)生外泌體，成功分離培養(yǎng)了裸鼴鼠皮膚成纖維細胞[13]，并對其純度進行了免疫熒光鑒定。

外泌體起源于晚期內(nèi)體的膜囊泡，與其他類型的囊泡相比，每個外泌體都有獨特的脂質(zhì)雙分子層。根據(jù)分離方法及粒徑大小可將外泌體與微泡、囊泡或凋亡小體等區(qū)分開，此外，外泌體獨有的表面蛋白如CD63、TSG101及其他相關(guān)受體等也可用于鑒定外泌體[14]。本研究使用超高速差速離心的方法分離并提取了成纖維細胞上清培養(yǎng)液，通過鑒定驗證了裸鼴鼠皮膚成纖維細胞能夠產(chǎn)生外泌體。蛋白質(zhì)印跡法分析中部分蛋白表達并未顯示唯一的條帶，可能與外泌體中的蛋白存在修飾的情況有關(guān)，有些蛋白被磷酸化和糖基化后會變大，有些蛋白被剪切后會變小。這種情況與國際上已發(fā)表外泌體的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果[15]也是一致的。值得注意的是，這種蛋白修飾情況是否與其他實驗動物有所區(qū)別，是否參與了某種生理或者病理過程，都需要進一步探討。

每個外泌體的生化組成都反映了它們的生物發(fā)生過程和起源。上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、B細胞和T細胞等均能夠釋放外泌體[16]。外泌體活性對于介導(dǎo)細胞通訊、免疫反應(yīng)、細胞信號再生和分化是必需的，甚至在病毒復(fù)制中也有報道，表明外泌體具有促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[17]。外泌體的起源和發(fā)育機制決定了它們的含量和生物學功能。例如，B淋巴細胞產(chǎn)生的外泌體包含主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）Ⅰ型、Ⅱ型和T細胞刺激分子，以誘導(dǎo)T細胞增殖[18]。癌細胞的外泌體包含影響細胞黏附以促進腫瘤進展的分子[19]。外泌體的含量也具有明顯的疾病特異性[1]。此外，有研究表明，外泌體以Hsp70依賴的方式預(yù)防心臟纖維化，并且隨著年齡的增長，心臟纖維化的增加可能部分歸因于外泌體中與衰老相關(guān)的Hsp70表達下降[20]。裸鼴鼠成纖維細胞分泌的超高分子量的透明質(zhì)酸表現(xiàn)了良好的抗衰老特性，其成纖維細胞分泌的外泌體是否也參與了抗衰老過程，仍然需要進一步探索。

綜上所述，本研究已經(jīng)初步證實了裸鼴鼠皮膚成纖維細胞能夠分泌外泌體，為今后研究外泌體在裸鼴鼠皮膚成纖維細胞中發(fā)揮作用的機制奠定了基礎(chǔ)。