基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究白藜蘆醇抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的分子機(jī)制

張曉節(jié)，蔣 磊

（安徽省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，合肥 230041）

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性或持續(xù)性缺血缺氧導(dǎo)致心肌組織壞死。心肌細(xì)胞大量死亡，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R）損傷是指心肌短時(shí)間內(nèi)供血不足或停止，之后又恢復(fù)供血，進(jìn)而造成心肌組織損傷的過(guò)程[1]。研究表明，導(dǎo)致MI/R損傷的機(jī)制包括細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、鈣超載，以及過(guò)量氧自由基的產(chǎn)生等[2-4]。目前，治療MI/R損傷的有效藥物尚不完全明確。

白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是存在于桑樹(shù)、花生或朝鮮槐等多種植物中的一種非黃酮類(lèi)多酚化合物。既往研究證實(shí)，RSV能夠通過(guò)減少M(fèi)I/R損傷、舒緩血管或者抗動(dòng)脈粥樣硬化等途徑發(fā)揮保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用[5-6]。然而，有關(guān)RSV治療MI/R損傷的具體分子機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于整體構(gòu)想，通過(guò)構(gòu)建多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)即關(guān)鍵靶基因，然后以此對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)作用機(jī)制進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)信息篩選方法，從RSV治療MI/R損傷的整體分子作用角度出發(fā)，探尋RSV治療的有效靶基因，然后通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RSV治療MI/R損傷的分子機(jī)制，為RSV應(yīng)用于臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量為（200±20）g，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK（皖）2017-001]。所有大鼠在25 ℃左右、相對(duì)濕度為40%～70%的環(huán)境[SYXK（皖）2017-004]中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（IACUC：20170625006）

1.2 藥物與試劑

RSV粉末（純度高于99%）和戊巴比妥鈉（批號(hào)：57-33-0）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)用兔抗caspase-3單克隆抗體（#9662）和小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（#3498）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，小鼠抗腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）單克隆抗體（15497-1-AP）購(gòu)自中國(guó)武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗GAPDH單克隆抗體（AF5009）、一抗稀釋液、二抗稀釋液、HE染色試劑盒和TUNEL染色試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗TRAIL一抗免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。大鼠血漿中乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）含量測(cè)定用試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 RSV與MI/R損傷靶基因篩選及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選得到RSV有效作用靶基因，然后采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）篩選得到MI/R損傷相關(guān)靶基因。最后運(yùn)用R語(yǔ)言軟件包中的VennDiagram程序包，對(duì)RSV作用與MI/R損傷相關(guān)的靶基因取交集，再利用Cytoscape軟件（https://cytoscape.org/），導(dǎo)入這些交集基因，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

運(yùn)用R語(yǔ)言軟件包中的String和Colorspace程序包，對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO功能富集分析，并畫(huà)出關(guān)鍵基因的富集分析柱狀圖及氣泡圖。使用模糊聚類(lèi)算法，以注釋共同度為基礎(chǔ)，對(duì)基因進(jìn)行聚類(lèi)計(jì)算，得出聚類(lèi)分值，該分值代表該基因在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要性。然后根據(jù)GO富集分析結(jié)果，運(yùn)用R語(yǔ)言軟件包中的Bioconductor程序包，進(jìn)行KEGG通路分析，得到RSV治療MI/R損傷涉及的主要信號(hào)通路。采用超幾何分布設(shè)計(jì)法進(jìn)行KEGG富集分析，富集分析的顯著性按照Benjamini-Hochberg校正法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 動(dòng)物建模與分組

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MI/R組）及藥物治療組（RSV組），每組各10只。采用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，大鼠四肢通過(guò)肢體導(dǎo)聯(lián)針與呼吸機(jī)連接，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，分離左側(cè)冠狀動(dòng)脈。Sham組只穿線(xiàn)不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；MI/R組和RSV組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支約40 min，然后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)再灌注2 h。在整個(gè)過(guò)程中，以缺血時(shí)心肌組織變白且心電圖ST段抬高，再灌注時(shí)心肌變紅且ST段下降，視為造模成功。RSV組大鼠于舌下靜脈滴注用生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）配制的RSV溶液（10 mg/kg），而Sham組和MI/R組均注射等量的生理鹽水。

1.6 血漿中 LDH、CK和cTnⅠ含量測(cè)定

對(duì)各組大鼠心臟取血，并將收取的血液放置于抗凝離心管內(nèi)，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上清液。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血漿中LDH、CK和cTnⅠ的含量，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，以此反映大鼠MI/R損傷后的心肌功能。

1.7 大鼠心肌梗死面積檢測(cè)

頸椎脫臼法處死大鼠，取各組大鼠心臟。垂直心臟長(zhǎng)軸，順心尖向底部的方向?qū)⑿呐K組織切片，切片厚度為5μm。將切片置于37 ℃、pH為7.4的TTC溶液中染色10 min，然后用4%的多聚甲醛溶液固定。缺血心肌組織呈現(xiàn)白色，正常的心肌組織為血紅色，心肌梗死面積相對(duì)百分比＝白色區(qū)域面積/血紅色區(qū)域面積×100%。

1.8 HE染色觀(guān)察心肌結(jié)構(gòu)

取大鼠心肌組織，用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，再用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液梯度脫水，然后用二甲苯進(jìn)行組織透明，最后經(jīng)石蠟包埋，切片。使用HE染色試劑盒，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察心肌組織結(jié)構(gòu)。

1.9 TUNEL染色觀(guān)察心肌細(xì)胞凋亡

將大鼠心肌組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內(nèi)脫蠟，然后使用二甲苯浸洗2次，每次約5 min。之后用梯度乙醇溶液（100%、95%、80%、70%）清洗各1次，每次約3 min。采用Proteinase K工作液處理心肌組織切片20 min，并在室溫條件下加入細(xì)胞通透液孵育10 min。PBS清洗切片，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，反應(yīng)30 min。切片風(fēng)干后，加入50 μL的 Converter-POD，加上蓋玻片，37 ℃孵育30 min。PBS清洗切片后，加入DAB顯色液，孵育10 min，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目并拍照。細(xì)胞凋亡率（%）＝TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%。

1.10 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TRAIL蛋白表達(dá)

將大鼠心肌組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內(nèi)脫蠟，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脫水。將心肌組織切片置于10 nmol/L的檸檬酸鹽緩沖液中，90 ℃抗原修復(fù)30 min。室溫條件下，自然冷卻并用去離子水緩慢沖洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封閉20 min。加入小鼠抗TRAIL單克隆抗體（工作液體積稀釋比例為1∶200），4℃條件下孵育過(guò)夜。加入山羊抗小鼠二抗，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯色后拍照，觀(guān)察心肌組織中TRAIL蛋白表達(dá)情況。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)caspase-3、Bcl-2和TRAIL表達(dá)

取大鼠心肌組織，PBS潤(rùn)洗1～2次，加入細(xì)胞組織裂解液（體積比為1∶5），冰上裂解1 h；4℃，12 000×g離心15 min，收集上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)；然后取心肌細(xì)胞總蛋白30μg，上樣至聚丙烯酰胺凝膠，80 V電泳30 min后，轉(zhuǎn)120 V電泳60 min，溴酚藍(lán)指示電泳至凝膠最底層。依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小，切取目的膠條，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)2h。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗caspase-3單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗TRAIL單克隆抗體（1∶1 000）和兔抗GAPDH（1∶5 000）單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜；再加入對(duì)應(yīng)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h；搖床上加入TPBS洗滌3次，5min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。結(jié)果以各目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用單因素方差分析方法，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV作用與MI/R損傷靶基因交集及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)對(duì)RSV作用的128個(gè)藥效靶基因和MI/R損傷的1 231個(gè)基因靶點(diǎn)進(jìn)行基因交集篩選，得到86個(gè)可能與RSV治療MI/R損傷相關(guān)的基因作用靶點(diǎn)（圖1A），其中包括PTGS1、PTGS2、MAOB、RELA、STAT3、AKT1、VEGFA、CCND1、Bcl-2、Bcl-2-L1和caspase-3等。然后通過(guò)Cytoscape軟件成功構(gòu)建RSV治療MI/R損傷的相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖1B所示。

圖 1 RSV作用靶點(diǎn)和MI/R損傷相關(guān)基因的交集篩選圖（A）及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（B）Figure 1 Intersection screening diagram (A) and regulation network diagram (B) of resveratrol (RSV) target genes and myocardial ischemia-reperfusion (MI/R) damage-related genes

2.2 相關(guān)靶基因的GO富集功能與KEGG富集信號(hào)通路

GO富集分析可得到特定功能層次上由基因或蛋白數(shù)目構(gòu)成的有向無(wú)環(huán)圖，其中包括分子功能、細(xì)胞組分及生物過(guò)程3個(gè)方面。如圖2A所示，篩選得到的86個(gè)相關(guān)基因主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（repressing transcription factor binding）和激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（activating transcription factor binding）等功能。

采用R語(yǔ)言軟件包對(duì)篩選得到的86個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示共有157條信號(hào)通路，涉及參與糖尿病并發(fā)癥調(diào)控的AGE-RAGE信號(hào)通路、卡波肉瘤相關(guān)性皰疹病毒感染通路和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路（圖2B）。其中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路涉及的主要基因包括TRAIL、caspase-3、Bcl-2及Bax等（圖2C）。

2.3 RSV對(duì)大鼠心肌功能的影響

如表1顯示，與Sham組相比，MI/R組大鼠的血漿中LDH、CK和cTnⅠ含量均明顯增加（P＜0.01），心肌梗死面積也明顯增大（P＜0.01）；而相比于MI/R組，在給予RSV藥物干預(yù)后，大鼠心肌功能得到明顯改善，血漿LDH、CK和cTnⅠ含量均明顯降低（P＜0.01），心肌梗死面積明顯減少（P＜0.05）。

2.4 RSV對(duì)大鼠心肌結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示：Sham組心肌結(jié)構(gòu)正常；MI/R組大鼠的心肌纖維排列紊亂，且部分肌絲斷裂，間隙增寬；相比于MI/R組，RSV組大鼠的心肌纖維排列較為規(guī)則，心肌間隙變小，心肌細(xì)胞變形恢復(fù)較好（圖3）。

2.5 RSV對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果（圖4）顯示：相比于Sham組，MI/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；相比于MI/R組，RSV組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示：相比于Sham組，MI/R組大鼠心肌組織中caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；相比于MI/R組，RSV組大鼠心肌組織中caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。

圖 2 關(guān)鍵靶向基因的GO富集分析（A）和KEGG富集分析（B）柱狀圖以及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路圖（C）Figure 2 GO enrichment analysis (A) and KEGG enrichment analysis (B) histogram of key target genes and their related apoptosis signaling pathways (C)

表 1 RSV對(duì)MI/R大鼠心肌功能的影響Table 1 The effect of resveratrol (RSV) on the myocardial function of myocardial ischemia-reperfusion(MI/R) damaged rats(x- ± s, n=6)

圖 3 HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化Figure 3 Morphological changes of rat myocardium tissues after HE staining

圖 4 TUNEL染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡（×200）Figure 4 Apoptosis of rat cardiomyocytes after TUNEL staining (×200)

圖 5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RSV對(duì)心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of resveratrol (RSV) on the expressions of apoptosis-related proteins in rat myocardium by Western blotting

2.6 RSV對(duì)TRAIL蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果（圖6A）顯示：MI/R組大鼠心肌組織中TRAIL蛋白表達(dá)量增加，而給予RSV藥物處理后TRAIL表達(dá)水平降低。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖6B）顯示：相比于Sham組，MI/R組TRAIL蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；相比于MI/R組，RSV組TRAIL蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。

圖 6 RSV對(duì)大鼠心肌組織中TRAIL蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of resveratrol (RSV) on the expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) protein in rat myocardium

3 討論

RSV是一種天然多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于多種植物中，具有抗心血管疾病和抗腫瘤等多種生物活性。以往研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠MI/R損傷模型中，RSV能有效縮短室性心動(dòng)過(guò)速及室顫發(fā)生的持續(xù)時(shí)間，改善心肌損傷[7]。另外，RSV也能夠通過(guò)抗氧化、抗自由基作用，減少心肌細(xì)胞壞死[8]。RSV還能通過(guò)調(diào)控一氧化氮合酶/一氧化氮（NO）通路，促進(jìn)NO釋放，發(fā)揮對(duì)MI/R損傷的保護(hù)作用[9]。

已知氧化應(yīng)激在MI/R損傷中扮演重要作用。有文獻(xiàn)顯示，在MI/R損傷大鼠模型中，心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體功能出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，活性氧產(chǎn)生量異常增加，導(dǎo)致心肌梗死面積增大；而用RSV預(yù)處理MI/R損傷模型大鼠后，心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體功能得到明顯改善[10]。同時(shí)，炎性反應(yīng)是MI/R損傷的重要病理生理學(xué)機(jī)制[11]。在MI/R損傷的大鼠模型中炎性細(xì)胞因子水平顯著升高，而給予RSV處理后上述炎性細(xì)胞因子水平明顯降低，提示通過(guò)早期的RSV處理抑制炎性反應(yīng)，能夠有效地減輕MI/R損傷[12]。

在上述文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)RSV治療MI/R損傷的關(guān)鍵靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到RSV作用有效基因靶點(diǎn)共128個(gè)，用GeneCards篩選得到MI/R損傷相關(guān)靶基因共1 231個(gè)，兩者交集后共有86個(gè)可能成為RSV治療MI/R損傷的相關(guān)基因，其中包括Bcl-2、caspase-3和TRAIL等。以往研究表明，RSV能夠通過(guò)抑制caspase-3活性，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕MI/R損傷[13-14]。本研究進(jìn)一步采用Cytoscape軟件成功構(gòu)建了RSV治療MI/R損傷的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，涉及86個(gè)關(guān)鍵靶基因。通過(guò)GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵靶基因主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合和抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等生物學(xué)功能，而KEGG通路富集共涉及157條信號(hào)通路，其中排在前3位的是參與糖尿病并發(fā)癥調(diào)控的AGE-RAGE信號(hào)通路（29/86）、卡波肉瘤相關(guān)性皰疹病毒感染通路（26/23）和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路（23/86）。而在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中涉及23個(gè)基因，包括TRAIL、caspase-3和Bcl-2等基因。因此，本研究進(jìn)一步通過(guò)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RSV治療MI/R損傷可能與細(xì)胞凋亡通路及這3個(gè)基因表達(dá)有關(guān)。

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族成員之一，通過(guò)與其不同的受體結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)等病理生理學(xué)過(guò)程[15-16]。有文獻(xiàn)顯示，在胰腺癌細(xì)胞系（SW1990、PaTu8988和BxPC3）中，過(guò)表達(dá)TRAIL能夠上調(diào)TRAIL受體1和2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]；在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株中，體外聯(lián)合枸杞多糖和TRAIL能夠激活caspase-3活性，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性[18]。以上研究結(jié)果共同表明，TRAIL在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)TRAIL對(duì)MI/R損傷引起心肌細(xì)胞凋亡的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者基于前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果推測(cè)，RSV可能通過(guò)調(diào)控TRAIL表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MI/R損傷。因此，本課題組構(gòu)建了MI/R損傷大鼠模型，探究RSV能否通過(guò)抑制TRAIL表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕心肌損傷。HE染色結(jié)果顯示，與MI/R組大鼠相比，RSV組大鼠心肌纖維排列規(guī)則，心肌間隙變小。TUNEL染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低。進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MI/R組相比，RSV組caspase-3表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高。為明確RSV能否通過(guò)調(diào)控TRAIL表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，本研究采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRAIL蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：相比于Sham組，MI/R組TRAIL表達(dá)量顯著增加，而RSV處理后TRAIL表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果表明，RSV能夠通過(guò)調(diào)控TRAIL表達(dá)抑制MI/R心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)以及大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，RSV能夠抑制TRAIL蛋白表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕MI/R損傷；這為今后應(yīng)用RSV治療MI/R損傷提供了新的理論基礎(chǔ)。