朱頂紅根腐病病原菌的鑒定

孟慶忠，李孝鑒，易先達，李國榮，張 濤，呂 博

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，武漢 430064；2.元謀縣果然好農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南 楚雄 651300）

朱頂紅（Hippeastrum rutilum），又稱華胄蘭（華北經(jīng)濟植物志要）、對對紅、百枝蓮等，是石蒜科朱頂紅屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲。朱頂紅劍葉挺拔，花色豐富，花朵直徑5～30 cm、花葶高度10～70 cm，花瓣形態(tài)多樣，適宜盆栽、鮮切花生產(chǎn)、罐裝裸球（無需土壤及澆水）、道路綠化、庭院裝飾等，適應(yīng)種植環(huán)境廣、觀賞花葉俱佳，作為高檔觀賞花卉市場前景廣闊［1-4］。

目前，國內(nèi)科研單位報道多以組培快繁技術(shù)為主，針對病蟲害的研究較少。朱頂紅的花葉病毒病和紅斑病在栽培中較多常見，但對于朱頂紅根腐病認(rèn)識不足，很多購買進口種球的消費者在種植過程中經(jīng)常發(fā)生種球根盤腐爛，近而整株枯死，多是由于土壤通透性差、水肥管理不當(dāng)而引起的朱頂紅根腐病。進口朱頂紅種球僵球問題也困擾著消費者，一種原因可能是種球因過度低溫冷藏導(dǎo)致自身調(diào)節(jié)問題，有待試驗驗證；另一種原因可能是新根萌發(fā)后受到根腐病病菌侵染，導(dǎo)致根尖發(fā)紅腐爛，進而產(chǎn)生僵球現(xiàn)象。魯憲［5］研究指出，朱頂紅根腐病從根部侵染，引起根部腐爛，慢慢擴展至種球，引起種球腐爛。染病葉片呈現(xiàn)出不規(guī)則紅褐色，進而引起早期黃葉。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法，對朱頂紅根腐病的病原菌進行鑒定，為防治朱頂紅根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

供試材料為進口朱頂紅品種花瓶（Gervase），取新萌發(fā)的發(fā)病根組織（圖1）帶回實驗室進行病菌分離。病原菌分離采用常規(guī)組織分離法：發(fā)病根組織洗凈后切成2～3 mm 的小段，置于3% 次氯酸鈉溶液中浸泡45 s，然后轉(zhuǎn)入75%乙醇溶液中浸泡60 s，再用無菌水清洗3 次，在無菌濾紙上吸干水分，最后用無菌手術(shù)鑷將其轉(zhuǎn)入馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板中，25 ℃培養(yǎng)5 d。

圖1 朱頂紅根腐病根部

1.2 病原菌的單孢純化

挑取新鮮菌絲于Czapek 液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃下160 r∕min 振蕩培養(yǎng)7 d，經(jīng)3 層無菌紗布過濾后，吸取少量孢子液于血球計數(shù)板中，在40 倍光學(xué)顯微鏡下測定孢子液濃度，并用無菌水將孢子液濃度稀釋至106個孢子∕mL。再用無菌槍頭吸取1 μL 孢子液于PDA 平板中，加入100 μL 無菌水涂布均勻，25 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取病原菌單菌落。

1.3 病原菌接種

菌株采用活體接種。試驗設(shè)置a（劃傷根部對照）、b（劃傷根部接種）、c（幼嫩根部無劃傷對照）、d（幼嫩根部無劃傷接種）4 種處理。盆栽朱頂紅品種為進口品種艾斯黛拉（Estella），盆栽土壤經(jīng)過121 ℃、120 min 滅菌處理。小心挖出盆栽朱頂紅新鮮根部，減少根部損傷，無菌水沖洗掉根表面土壤，用無菌雙刃刀片劃傷根部，脫脂棉浸透孢子液，包裹根部，對照采用無菌水浸透脫脂棉包裹，盆栽朱頂紅置于25 ℃培養(yǎng)室，5 d 后取樣觀察。

1.4 病原的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定：將病原菌接種于新鮮PDA 平板上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況。挑取邊緣菌絲于Czapek 液體培養(yǎng)基中，25 ℃條件下160 r∕min 振蕩培養(yǎng)7 d，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)特征。

2）分子鑒定：采用CTAB 法提取病原菌菌絲DNA。采用PCR 擴增核糖體RNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因，ITS 基因擴增使用的引物為ITS1 和ITS4，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。20 μL PCR 擴增體系：7 μL ddH2O、10 μL PCR Mix 試劑、Primer-1 和Primer-2 各1 μL、DNA 模板1 μL。PCR 產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，并將得到的基因序列與NCBI 基因庫中的序列進行對比，確定菌株分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌特征

病原菌在PDA 平板上的菌落呈圓形，菌絲最初為白色絨毛狀，隨時間菌落逐漸變?yōu)闇\黃色。菌落中分生孢子有2 種形態(tài)，小型分生孢子卵圓形或橢圓形，有1～2 個橫隔，大小為（19.5～20.5）μm×（5.4～6.8）μm；大型分生孢子較直或稍彎曲為鐮刀形，有較多橫隔，大小為（27～43）μm×（4.5～5.4）μm。

圖2 病原菌菌落正面（a）；病原菌菌落背面（b）；病原菌分生孢子形態(tài)（c）

2.2 病原菌接種觀察

劃傷根部對照傷口輕微發(fā)紅（圖3a），可能是由于機械損傷導(dǎo)致朱頂紅種球根組織酚類物質(zhì)氧化物積累所致。劃傷根部接種病菌（圖3b）傷口處腐爛潰縮，呈紅色并沿導(dǎo)管方向擴展，根表面可見白色菌絲。幼嫩根部未劃傷接種（圖3d）可見根部表皮變紅，根尖侵染變紅，幼嫩根部未劃傷對照（圖3c）未見異常病變，根尖正常。從發(fā)病根部上可重新分離得到該病原菌，重新分離得到的病原菌的培養(yǎng)性狀，分生孢子形態(tài)及大小均與最初分離到的菌株相同，確定該菌株即為病原菌。

圖3 人工接種菌株致病性測定

2.3 病原菌測序結(jié)果

將所得序列在NCBI 基因庫中進行序列對比，該病原菌菌株與Fusarium solanistrain F13 菌株的相似性為100%，片段大小為537 bp，其登錄號為KP310868.1。

3 小結(jié)與討論

有關(guān)朱頂紅根腐病病原菌的鑒定研究僅限于形態(tài)學(xué)方面，鑒定結(jié)果可能導(dǎo)致一定程度的誤差。目前國際上利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合鑒定病原菌已成為一種趨勢［6-10］。綜合病原形態(tài)特征、ITS 序列比對結(jié)果，初步確定引起朱頂紅根腐病的病原菌為半知菌類叢梗孢目（Moniliales）瘤座孢科（Tuber?culariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的腐皮鐮刀菌（Fu?sarium solani）。

朱頂紅根腐病是一種嚴(yán)重的真菌病害，侵染全株疏導(dǎo)組織感染，進而引發(fā)整株腐爛枯死。其病原菌存在于土壤中，主要侵染根部，剛萌動的新根根尖易感染，使根尖發(fā)紅腐爛，對朱頂紅的品種繁育和栽培管理危害較大。目前，國內(nèi)銷售的商品球大部分都是荷蘭、南非等國進口，對于國內(nèi)消費者來說，其價格昂貴，國內(nèi)有關(guān)朱頂紅育種與商品種球生產(chǎn)很少，嚴(yán)重制約朱頂紅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，商品種球國產(chǎn)化是朱頂紅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大瓶頸，配套栽培技術(shù)方面的研究也相對滯后。呂英民等［11］指出引起朱頂紅根腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌，這與本研究結(jié)果不一致，可能由于種植品種、區(qū)域土壤環(huán)境和鑒定方法不同，本研究未分離鑒定出尖孢鐮刀菌。本研究初步確定了腐皮鐮刀菌是引起朱頂紅根腐病的病原菌之一，為朱頂紅栽培管理上提供理論依據(jù)。