全可吸收人工韌帶的制備與功能性評(píng)價(jià)

黃云帆，林 婧，謝曉靜，盧 俊，勞繼紅，王 璐

(東華大學(xué) a. 紡織學(xué)院；b. 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)內(nèi)重要的韌帶結(jié)構(gòu)，其主要功能是防止股骨后移或脛骨過(guò)度前移，維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定并協(xié)助控制膝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)和側(cè)方運(yùn)動(dòng)[1]。據(jù)報(bào)道[2-3]，美國(guó)每年有20萬(wàn)例前交叉韌帶損傷病例，且由于關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜液的存在以及ACL本身的低血管化，其損傷時(shí)無(wú)法形成血凝塊，因而難以發(fā)生內(nèi)源性愈合，需要手術(shù)介入治療。目前，臨床使用最廣泛的治療方法為自體移植、同種異體移植以及人工韌帶重建。然而，自體移植受供體部位并發(fā)癥與來(lái)源的限制，同種異體移植面臨免疫排斥、疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)[1-2, 4-6]。而人工韌帶的臨床應(yīng)用更為廣泛，且其需求日益增加。

人工韌帶在20世紀(jì)七八十年代開(kāi)始出現(xiàn)并逐步興起[6]，其第一代產(chǎn)品包括原材料為聚四氟乙烯的Gore-Tex韌帶，原材料為聚丙烯的Polyflex韌帶，以及以碳纖維為基材的Proplast韌帶，但這些產(chǎn)品因植入人體后出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔周?chē)M織發(fā)育不良、并發(fā)癥高等問(wèn)題而逐步退出市場(chǎng)。隨后Dacron、Pro-Flex和Kennedy等人工韌帶面世，其短期療效較佳，但中遠(yuǎn)期組織無(wú)法向內(nèi)生長(zhǎng)且滑膜異物反應(yīng)嚴(yán)重[7]。目前，臨床受用最廣泛的人工韌帶是法國(guó)的LARS人工韌帶，其強(qiáng)度較高，并且其經(jīng)編結(jié)構(gòu)賦予韌帶織物以一定的孔隙率，可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]，短中期修復(fù)效果良好，但長(zhǎng)期隨訪(fǎng)結(jié)果表明，LARS人工韌帶所使用的不可吸收聚酯材料長(zhǎng)期存在于膝關(guān)節(jié)內(nèi)，材料與骨界面、材料與材料之間磨損產(chǎn)生的碎屑將引發(fā)關(guān)節(jié)炎等疾病，并且LARS人工韌帶在服役期持續(xù)的高強(qiáng)度對(duì)新生組織存在應(yīng)力遮擋效應(yīng)，而且無(wú)法誘導(dǎo)再生形成完整的自體韌帶[9-11]。

本文擬制備一種可吸收人工韌帶，通過(guò)探究可吸收材料不同組分配比以及人工韌帶編織結(jié)構(gòu)對(duì)其力學(xué)性能與降解性能的影響，研發(fā)一種高強(qiáng)度、多組分、核殼結(jié)構(gòu)的可吸收人工韌帶，使其在植入初期具有較高的強(qiáng)度，并且隨著材料的逐步降解以及新生組織的長(zhǎng)入，使自體韌帶承受適當(dāng)強(qiáng)度的負(fù)荷但無(wú)斷裂風(fēng)險(xiǎn)，以確保服役期移植物的力學(xué)性能。

1 材料與方法

1.1 纖維材料的選擇

文獻(xiàn)[12-13]指出：前交叉韌帶重建術(shù)后6周內(nèi)，移植物將經(jīng)歷無(wú)血管化壞死和新生血管形成兩個(gè)階段，可觀(guān)察到少量無(wú)序膠原纖維；6～24周，新生韌帶重塑，基本恢復(fù)其原有功能。由此可見(jiàn)，人工韌帶需要在6周內(nèi)保持優(yōu)良的力學(xué)性能，6～24周，為組織長(zhǎng)入提供空間同時(shí)維持一定的力學(xué)強(qiáng)度。故本文選用3種可吸收材料，即PPDO(polydioxanone)、PGCL(poliglecaprone)和PGLA(polyglactin)(蘇州邁緹康醫(yī)療科技有限公司)。紗線(xiàn)規(guī)格及其力學(xué)性能如表1所示，每根PGLA復(fù)絲由300根直徑為5 μm的單絲組成。其中，紗線(xiàn)拉伸性能參照GB/T 3916—2013進(jìn)行測(cè)試，紗線(xiàn)直徑采用SMZ745T型立體顯微鏡(上海尼康儀器有限公司)測(cè)試。

表1 紗線(xiàn)規(guī)格及其力學(xué)性能

1.2 高強(qiáng)度、多組分、核殼結(jié)構(gòu)全可吸收人工韌帶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備

根據(jù)PPDO、PGCL與PGLA紗線(xiàn)的力學(xué)性能以及其在體內(nèi)完全吸收的時(shí)間(分別為180、90～120和56～70 d[14-15])，設(shè)計(jì)了2種組分配比，即PPDO、PGCL和PGLA紗線(xiàn)的根數(shù)分別為6∶4∶2和4∶6∶2，對(duì)應(yīng)的配比編號(hào)依次為A和B。由于中空結(jié)構(gòu)不利于細(xì)胞貼附增殖，無(wú)法為組織生長(zhǎng)提供載體[16]，影響韌帶修復(fù)速度與質(zhì)量，故本文設(shè)計(jì)了一種核殼管狀結(jié)構(gòu)，其殼層為單層(Ⅰ)或雙層(Ⅱ)，核層由不同股數(shù)的PPDO、PGCL和PGLA編織紗組成。核層與殼層編織結(jié)構(gòu)中，紗線(xiàn)呈軸向螺旋型上升排列，更適用于模擬人體ACL[17]，且可以為細(xì)胞的長(zhǎng)入提供空間，有利于物質(zhì)交換和細(xì)胞增殖。試樣組分配比與核殼結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)參數(shù)如表2所示，核殼管狀人工韌帶結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

表2 試樣組分配比與核殼結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)參數(shù)

在東華大學(xué)自主設(shè)計(jì)研發(fā)的一體成型編織機(jī)上進(jìn)行核層編織紗的織造成型，再將其作為內(nèi)芯引入殼層進(jìn)行一體化管狀織物編織成型。在DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器股份有限公司)中進(jìn)行熱定型，定型溫度為80 ℃，時(shí)間為40 min，制得直徑為3.5 mm的管狀試樣。

1.3 結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)試

采用SMZ745T型立體顯微鏡觀(guān)察人工韌帶的結(jié)構(gòu)特征，包括人工韌帶中紗線(xiàn)的分布。根據(jù)顯微鏡照片，使用MB-Ruler軟件測(cè)得人工韌帶的直徑、相鄰?fù)N紗線(xiàn)間的距離(節(jié)距)以及編織角。

1.4 力學(xué)性能測(cè)試

前交叉韌帶重建術(shù)后早期，韌帶斷裂是其面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)。而在康復(fù)階段的中后期，人工韌帶需在突然且快速的生理活動(dòng)后恢復(fù)原長(zhǎng)[18]，且具有一定的抗疲勞強(qiáng)度[19]。采用YG(B) 026G-500型醫(yī)用紡織品多功能強(qiáng)力儀(溫州大榮紡織儀器有限公司)測(cè)試人工韌帶的拉伸性能、彈性回復(fù)性能以及循環(huán)拉伸疲勞性能。每項(xiàng)測(cè)試中，試樣樣本數(shù)均為5，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.1 拉伸性能

將試樣以24 mm/min(2%/s)的速率拉伸直至斷裂，拉伸初始隔距為20 mm[20-21]。試樣斷裂強(qiáng)度的計(jì)算方法如式(1)所示。選取試樣應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)線(xiàn)性部分計(jì)算彈性模量[22]，如式(2)所示。

(1)

式中：σ為斷裂強(qiáng)度，MPa；F為斷裂強(qiáng)力，N；S為試樣橫截面積，mm2。

(2)

式中：E為彈性模量，MPa；ε為應(yīng)變。

1.4.2 彈性回復(fù)性能

一定次數(shù)的循環(huán)拉伸預(yù)處理可以提高試樣的模量，減小殘余形變，使應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)穩(wěn)定[18]。因此，所有試樣在進(jìn)行彈性回復(fù)測(cè)試前均進(jìn)行預(yù)處理，初始隔距為20 mm，預(yù)處理載荷為30 N，拉伸速度為120 mm/min，循環(huán)次數(shù)為10次。預(yù)處理后，進(jìn)行極限載荷下的單次彈性回復(fù)測(cè)試，極限載荷為46.8 MPa(接近但略小于人體ACL斷裂強(qiáng)度)，加載與卸載速度均為120 mm/min，停留時(shí)間為1 s[18]。單次加載-卸載循環(huán)曲線(xiàn)如圖2所示。

試樣彈性回復(fù)率按式(3)計(jì)算。

(3)

式中：L為總伸長(zhǎng)，mm；L′為殘余伸長(zhǎng)，mm。

1.4.3 循環(huán)拉伸疲勞性能

循環(huán)拉伸疲勞性能測(cè)試的定伸長(zhǎng)率為10%，拉伸速度與回程速度均為120 mm/min，反復(fù)次數(shù)為500次，循環(huán)拉伸后，將試樣再以24 mm/min的恒定速率拉伸直至斷裂[22]。試樣斷裂強(qiáng)度衰減率(Δσ)和彈性模量增加率(ΔE)的計(jì)算如式(4)和(5)所示。

(4)

式中：σ為循環(huán)拉伸前斷裂強(qiáng)度，MPa；σ′為循環(huán)拉伸后斷裂強(qiáng)度，MPa。

(5)

式中：E0為循環(huán)拉伸前彈性模量，MPa；E1為循環(huán)

拉伸后彈性模量，MPa。

1.5 體外加速降解試驗(yàn)

人工韌帶的再生誘導(dǎo)性能對(duì)于植入效果起著至關(guān)重要的作用，除了生物相容性涂層和生長(zhǎng)因子，孔隙也是組織長(zhǎng)入的關(guān)鍵因素之一[20]。目前關(guān)于可吸收人工韌帶的研究都采用單一材料，未涉及梯度化降解，且未達(dá)到較大的初始強(qiáng)度，結(jié)構(gòu)偏緊密且孔隙較少[23]，故在新生組織長(zhǎng)入過(guò)程中無(wú)法提供足夠的空間。

為快速觀(guān)測(cè)人工韌帶的降解過(guò)程，將試樣浸沒(méi)在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在恒溫?fù)u床中保持50 ℃、60 r/min的降解條件，每2 d換液一次，取樣時(shí)間分別為0、3、6、9、12、18、24、30和36 d，試樣取出后用去離子水清洗，用濾紙擦干表面水分，于-20 ℃冰箱中冷凍24 h后再冷凍干燥24 h。

1.6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將試樣充分剪碎并混勻，放入酒精缸過(guò)夜滅菌，按照0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)[24]加入含血清的完全培養(yǎng)基(90% DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗+1%丙酮酸鈉)，在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中浸提24 h。以每孔105個(gè)細(xì)胞密度接種在96孔板上，再加入100 μL待測(cè)液體(試驗(yàn)組：100%浸提液；陰性對(duì)照組：完全培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組：10%DMSO溶液)。培養(yǎng)1、3和5 d后取出，使用酶聯(lián)測(cè)試儀(美國(guó)Thermo公司)測(cè)試各孔的吸光度(OD)值，選擇波長(zhǎng)450 nm。通過(guò)式(5)計(jì)算得出細(xì)胞的相對(duì)增殖率(Rgr)。根據(jù)表3中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性[25]。

(5)

式中：ODm和ODn分別為試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的平均OD值。

表3 細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)法比較樣本間的顯著性差異，置信區(qū)間為[0,0.95]。不同試樣間斷裂強(qiáng)度、彈性模量以及循環(huán)拉伸前后試樣的斷裂強(qiáng)度和彈性模量進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工韌帶的結(jié)構(gòu)參數(shù)

人工韌帶的結(jié)構(gòu)特征如圖3所示，其中，藍(lán)色紗線(xiàn)為PPDO，金色透明紗線(xiàn)為PGCL，白色復(fù)絲為PGLA。由圖3可以看出，在殼層與核層結(jié)構(gòu)中，3種紗線(xiàn)沿軸向螺旋上升排列，彼此交織。6種人工韌帶試樣的結(jié)構(gòu)參數(shù)如表4所示。

表4 試樣的結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2 人工韌帶的力學(xué)性能

2.2.1 拉伸性能

試樣的拉伸斷裂測(cè)試結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，6種試樣的斷裂強(qiáng)度均大于人自體ACL的斷裂強(qiáng)度(48.24 MPa)，試樣Ab和Bb的彈性模量高于人自體ACL的彈性模量(111 MPa)[17, 26]。

當(dāng)3種紗線(xiàn)組分配比相同時(shí)，3類(lèi)不同編織結(jié)構(gòu)人工韌帶的斷裂強(qiáng)度與彈性模量間的關(guān)系分別為Ab>Aa>Ac，Bb>Ba>Bc(P<0.05)，即編織結(jié)構(gòu)b的斷裂強(qiáng)度與彈性模量最高，c最低。雖然3種編織結(jié)構(gòu)中PPDO、PGCL和PGLA紗線(xiàn)的總根數(shù)相同，但由于核層編織紗的編織角顯著小于殼層編織結(jié)構(gòu)(P<0.05)，因此，核層為主要承力結(jié)構(gòu)，而殼層起包覆作用。結(jié)構(gòu)b核層的6根6股編織紗間的排列比結(jié)構(gòu)a核層的3根12股編織紗更緊密，抱合力更大；結(jié)構(gòu)b核層編織紗的編織角(Ab和Bb試樣分別為20.60°和24.91°)比結(jié)構(gòu)a核層的編織角(Aa和Ba試樣分別為29.29°和29.82°)小。由此可見(jiàn)，核層編織紗的結(jié)構(gòu)以及紗線(xiàn)根數(shù)的差異導(dǎo)致不同試樣的力學(xué)性能出現(xiàn)差異。因此，當(dāng)試樣受到軸向拉伸時(shí)，有更多的紗線(xiàn)承擔(dān)軸向拉伸載荷，提高了試樣的強(qiáng)度與模量。具有結(jié)構(gòu)c的試樣斷裂強(qiáng)度與彈性模量顯著低于結(jié)構(gòu)a和b(P<0.05)。這是由于結(jié)構(gòu)c的核層為2根12股編織紗，其能夠承擔(dān)軸向拉力的紗線(xiàn)根數(shù)僅為結(jié)構(gòu)a和b的2/3，這種結(jié)構(gòu)的人工韌帶試樣植入人體后將極易斷裂或失效。因此，本文優(yōu)選試樣Aa、Ab、Ba和Bb做進(jìn)一步分析全可吸收人工韌帶的彈性回復(fù)性能和疲勞性能。

2.2.2 彈性回復(fù)性能

試樣的彈性回復(fù)率測(cè)試結(jié)果如表5所示，加載-卸載單次循環(huán)曲線(xiàn)如圖5所示。由表5可知，各試樣的彈性回復(fù)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。文獻(xiàn)[18, 27]研究表明，編織人工韌帶在接近人體ACL斷裂強(qiáng)度(48.24 MPa)時(shí)的彈性回復(fù)率為30%～50%。本文所設(shè)計(jì)的試樣(Aa、Ab、Ba和Bb)在接近人體ACL斷裂強(qiáng)度時(shí)的彈性回復(fù)率均高于上述文獻(xiàn)所述的結(jié)果，表明本文所設(shè)計(jì)的人工韌帶具有著優(yōu)異的回縮變形能力，能夠在人體經(jīng)歷生理活動(dòng)后快速恢復(fù)其原長(zhǎng)，從而維持股骨和脛骨的相對(duì)位置。

表5 試樣的彈性回復(fù)率

2.2.3 循環(huán)拉伸疲勞性能

人工韌帶植入人體后須能夠承受循環(huán)載荷，并允許膝關(guān)節(jié)在一定范圍內(nèi)運(yùn)動(dòng)而不受損傷[22]。在經(jīng)過(guò)500次循環(huán)拉伸后，試樣的拉伸斷裂測(cè)試結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知：循環(huán)拉伸后，所有試樣的斷裂強(qiáng)度仍顯著大于人自體ACL斷裂強(qiáng)度。試樣Aa、Ab、Ba和Bb的斷裂強(qiáng)度分別降低了10.21%、7.81%、5.33%和4.15%，試樣Ba和Bb的斷裂強(qiáng)度較循環(huán)拉伸前無(wú)顯著性下降(P>0.05)。這是因?yàn)椋c組分配比為A(PPDO∶PGCL∶PGLA=6∶4∶2)的試樣相比，組分配比為B(PPDO∶PGCL∶PGLA=4∶6∶2)的試樣中PGCL紗線(xiàn)根數(shù)多，而PGCL紗線(xiàn)的斷裂強(qiáng)度大于PPDO紗線(xiàn)，因此循環(huán)拉伸對(duì)試樣Ba和Bb的拉伸性能影響較小，使得這兩種試樣的強(qiáng)度衰減率較低。所有試樣在循環(huán)拉伸后，彈性模量均有所增加。在拉伸過(guò)程中，編織結(jié)構(gòu)中的紗線(xiàn)在循環(huán)載荷的作用下，發(fā)生移動(dòng)與重排，更多的紗線(xiàn)趨于軸向排列，編織角減小，因此試樣的彈性模量增大[27]。

2.3 體外降解性能

選取斷裂強(qiáng)度與彈性模量最高的試樣Ab、Bb進(jìn)行體外加速降解試驗(yàn)。不同降解周期時(shí)的人工韌帶試樣的表觀(guān)形態(tài)如圖7所示。

由圖7可以看出：降解前，人工韌帶試樣的3種紗線(xiàn)緊密交織；降解12 d后，試樣Ab和Bb中PGLA紗線(xiàn)發(fā)生斷裂，PGCL紗線(xiàn)表面出現(xiàn)縱向裂紋；降解36 d后，人工韌帶中的PGLA與PGCL紗線(xiàn)已完全降解脫落，剩下降解周期較長(zhǎng)的PPDO組分維持人工韌帶的骨架。在降解前期，3種紗線(xiàn)共同支撐人工韌帶的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，隨著PGLA與PGCL紗線(xiàn)的降解，人工韌帶出現(xiàn)更多的孔隙，PPDO紗線(xiàn)螺旋纏繞組成其基本框架，提供力學(xué)性能，同時(shí)為后續(xù)原位植入后組織的長(zhǎng)入提供足夠的空間。

體外加速降解試驗(yàn)于50 ℃下進(jìn)行，升溫加速降解過(guò)程中，聚合物材料未發(fā)生相變，即材料降解機(jī)制不變。文獻(xiàn)[28]指出，50 ℃下材料的降解速率約為人體內(nèi)環(huán)境溫度(37 ℃)下降解速率的4.67倍。即試樣在體外50 ℃環(huán)境下降解12和36 d分別相當(dāng)于在體內(nèi)降解8和24周，此時(shí)人工韌帶的纖維與纖維間的空隙逐漸增大，允許新生組織沿剩余纖維爬行生長(zhǎng)，形成自體韌帶。由此可見(jiàn)，人工韌帶的梯度化降解周期與前交叉韌帶修復(fù)術(shù)后細(xì)胞增殖和組織長(zhǎng)入的時(shí)間基本匹配，與韌帶愈合周期基本吻合，即基本滿(mǎn)足臨床對(duì)于人工韌帶可控梯度化降解的需求。

2.4 細(xì)胞毒性

試樣細(xì)胞相對(duì)增殖率測(cè)試結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，細(xì)胞在試樣Ab和Bb浸提液中培養(yǎng)5 d后的相對(duì)增殖率分別為101.65%和96.74%。相比第1 d，試樣Ab和Bb第5 d的細(xì)胞相對(duì)增殖率分別下降2.89%和1.15%，兩種試樣的細(xì)胞相對(duì)增殖率無(wú)顯著性下降(P>0.05)。試樣Ab和Bb的細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)分別為0和1[25]，無(wú)細(xì)胞毒性，表明由本文所選用的3種可吸收材料制備的不同結(jié)構(gòu)的人工韌帶均具有良好的細(xì)胞相容性。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文設(shè)計(jì)并制備了6種核殼結(jié)構(gòu)的全可吸收人工韌帶，研究了組分配比和編織結(jié)構(gòu)(核層和殼層)對(duì)人工韌帶力學(xué)性能、降解性能以及細(xì)胞相容性的影響。結(jié)果表明，試樣Ab(組分配比PPDO∶PGCL∶PGLA=6∶4∶2，編織結(jié)構(gòu)為6×6+Ⅰ)與Bb(組分配比PPDO∶PGCL∶PGLA=4∶6∶2，編織結(jié)構(gòu)為6×6+Ⅰ)的拉伸性能和彈性回復(fù)性能更為優(yōu)異，循環(huán)拉伸后仍滿(mǎn)足人工韌帶的力學(xué)要求，且具有較好的抗疲勞強(qiáng)度。體外加速降解試驗(yàn)結(jié)果表明，本文所設(shè)計(jì)的人工韌帶試樣的降解時(shí)間與組織長(zhǎng)入時(shí)間基本匹配，符合人工韌帶的臨床功能性要求，且所有試樣均無(wú)細(xì)胞毒性。后續(xù)有待于進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物試驗(yàn)以研究全可吸收人工韌帶的原位降解性能與組織再生匹配性。