4種龜肉酶解液的氨基酸對(duì)比分析

黃百祺，楊昭，王如意，黃創(chuàng)成，吳巨賢，鄒琴*

(1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣州 510430；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣州 510430；3.四會(huì)市康源水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，廣東 肇慶 526200)

廣東省是我國(guó)龜鱉類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模最大的省份之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，廣東省食用龜養(yǎng)殖存量上中國(guó)龜種以黃喉擬水龜(Mauremysmutica，俗稱(chēng)石金錢(qián)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)石龜)最多，其次為中華草龜(Chinemysreevesii，以下簡(jiǎn)稱(chēng)草龜)、中華花龜(Ocadiasinensis，以下簡(jiǎn)稱(chēng)花龜)，外國(guó)龜種以鱷龜(Chelydraserpentina)最多[1]。研究表明，石龜、草龜、花龜、鱷龜肉粗蛋白含量約為17%[2-4]，其氨基酸組成比例符合FAO/WHO的推薦標(biāo)準(zhǔn)，是一種高蛋白、低脂肪的肉類(lèi)和優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源。目前，對(duì)這4種龜肉的利用仍以鮮食為主，隨著養(yǎng)殖技術(shù)不斷提高和規(guī)模逐步擴(kuò)大，以及對(duì)龜肉生理活性作用的深入研究[5]，人們對(duì)龜肉食用價(jià)值的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高，對(duì)龜肉深加工制品也提出了新的要求。酶解技術(shù)是制備肉類(lèi)衍生化、高值化深加工產(chǎn)品的有效方法之一。肉類(lèi)經(jīng)酶水解后產(chǎn)生大量溶解性好、易于吸收消化的短肽和游離氨基酸，其在一定條件下能與還原糖、脂類(lèi)等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生肉味和烹調(diào)效果的香氣[6]。

利用酶解技術(shù)制備肉類(lèi)水解蛋白時(shí)，由于不同蛋白酶在水解方式和酶切位點(diǎn)上存在差異，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的組成和含量不同，直接影響其風(fēng)味，故蛋白酶的選擇至關(guān)重要[7]。復(fù)合蛋白酶既有內(nèi)切酶，也有外切酶，利用其制備酶解產(chǎn)物時(shí)在風(fēng)味、氨基酸含量等方面具有一定優(yōu)勢(shì)。徐永霞等[8]選用復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等對(duì)藍(lán)蛤進(jìn)行單酶酶解，結(jié)果表明復(fù)合蛋白酶組中游離氨基酸總量最高，酶解液的風(fēng)味較佳；李冬梅等[9]研究了不同蛋白酶對(duì)蝦頭水解物風(fēng)味的影響，發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶水解液中的多肽含量及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的鮮味氨基酸含量最高；陳宇等[10]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理的鹵鴨在色澤、形態(tài)等感官指標(biāo)方面較單一酶更佳。

目前，關(guān)于上述4種龜肉精深加工特別是酶解工藝的研究報(bào)道較少，限制了其商業(yè)價(jià)值和資源的高值化利用。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合蛋白酶對(duì)石龜、草龜、花龜、鱷龜肉進(jìn)行酶解，對(duì)比不同龜肉酶解產(chǎn)物中總氨基酸和游離氨基酸的組成和含量，對(duì)其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)并分析酶解產(chǎn)物的呈味特性，為4種龜肉的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃喉擬水龜、中華草龜、中華花龜、鱷龜：由四會(huì)市康源水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)提供；胰蛋白酶(酶活4000 U/g)：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；風(fēng)味蛋白酶(酶活500 LAPU/g)：丹麥諾維信公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E電子天平、FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多有限公司；JYS-A960絞肉機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；BWS-12精密恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將活龜去頭放血，取可食用部位肉，用絞肉機(jī)絞碎混勻，在-18 ℃低溫保存，備用。

1.3.2 酶解液制備

將凍藏龜肉置于室溫溶解后，準(zhǔn)確稱(chēng)取50 g，加入8倍蒸餾水，打漿后調(diào)pH至7.0，分別加入漿液總重量0.6%的胰蛋白酶和0.3%的風(fēng)味蛋白酶，攪拌均勻后置于500 mL三角瓶中，在55 ℃水浴搖床中酶解3 h。酶解結(jié)束后，將盛有酶解液的三角瓶置于水浴鍋中95 ℃滅酶20 min。將酶解液在室溫冷卻后，在 4 ℃條件下以8000 r/min離心10 min，取上清液即為龜肉酶解液，在-18 ℃凍存?zhèn)溆肹11]。

1.3.3 氨基酸測(cè)定

總氨基酸和游離氨基酸的測(cè)定參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定16種氨基酸的含量。由于采用酸水解法處理樣品，故未檢測(cè)色氨酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

總氨基酸分析：分別統(tǒng)計(jì)總氨基酸(total amino acid，TAA)含量、必需氨基酸(essential amino acid，EAA)含量、非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)含量[12]。游離氨基酸分析：分別統(tǒng)計(jì)總游離氨基酸(total free amino acid，TFAA)和呈味氨基酸的含量。游離氨基酸呈味強(qiáng)度值(taste activity value，TAV)是指某游離氨基酸的含量與該游離氨基酸呈味閾值的比值[13]。所有測(cè)定均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種龜肉酶解液總氨基酸分析

由表1可知，4種龜肉的酶解液中均檢測(cè)到16種氨基酸，表明這4種龜肉中氨基酸的種類(lèi)較豐富，但在總氨基酸含量上存在差異，4種龜肉酶解液總氨基酸含量大小依次為草龜>花龜>石龜>鱷龜，分別為23.577，23.004，22.936，21.849 mg/g。4種龜肉酶解液中含量最高的3種氨基酸排列規(guī)律相同，均為谷氨酸最高，其次為天冬氨酸和賴(lài)氨酸，含量最低的氨基酸均為蛋氨酸，與文獻(xiàn)[2]和文獻(xiàn)[3]一致，表明這幾種氨基酸在部分龜鱉科動(dòng)物中的分布可能具有一定規(guī)律性。草龜肉酶解液中谷氨酸、天冬氨酸和賴(lài)氨酸的含量均為4種龜肉酶解液中最高，最低均為鱷龜肉酶解液，這可能與4種龜肉酶解液的總氨基酸含量大小存在關(guān)聯(lián)性。4種龜肉酶解液中均有12種氨基酸的含量>1.0 mg/g，且種類(lèi)均相同；脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸這4種氨基酸在4種龜肉酶解液中的含量均<1.0 mg/g。

表1 4種龜肉酶解液總氨基酸分析Table 1 The analysis of total amino acids of enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

續(xù) 表

龜肉酶解產(chǎn)物作為呈味基料，不僅要求其具有良好的風(fēng)味感官，還需要有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于其所含的EAA種類(lèi)和組成比例，EAA組成比例與人體所需氨基酸比例越接近，則其品質(zhì)越佳。4種龜肉酶解液中均含有7種EAA，EAA總量大小依次為草龜(9.271 mg/g)>花龜(9.134 mg/g)>石龜(9.088 mg/g)>鱷龜(8.284 mg/g)肉酶解液，EAA/TAA分別為39.32%、39.71%、39.61%、37.91%，EAA/NEAA分別為64.81%、65.85%、65.62%、61.07%。根據(jù)FAO/WHO規(guī)定的EAA/TAA為40%、EAA/NEAA為60%的標(biāo)準(zhǔn)，花龜、草龜、石龜肉酶解液的EAA/TAA較接近40%，EAA/NEAA均>60%，表明這3種龜肉酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

2.2 4種龜肉酶解液游離氨基酸分析

游離氨基酸不僅大部分本身具有特殊滋味，而且可以通過(guò)脫羧、脫氨等作用生成其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)食物的整體風(fēng)味產(chǎn)生重要影響，還可作為Maillard反應(yīng)的底物，為酶解產(chǎn)物制備熱反應(yīng)型肉味香精提供物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。

表2 4種龜肉酶解液游離氨基酸分析Table 2 The analysis of free amino acids of enzymatic hydrolysates in four kinds of Emydidae meat

由表2可知，4種龜肉酶解液中均含有16種游離氨基酸。TFAA含量最高的是花龜肉酶解液(11.058 mg/g)，其次為草龜肉酶解液(10.449 mg/g)、石龜肉酶解液(10.087 mg/g)，最低為鱷龜肉酶解液(9.077 mg/g)。4種龜肉酶解液TFAA的大小排序與其TAA的順序不完全一致，這可能是由于不同種類(lèi)龜肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)存在差異，導(dǎo)致復(fù)合蛋白酶對(duì)其切割方式和效率不同。4種龜肉酶解液中含量和百分比最高的兩種FAA均為賴(lài)氨酸、亮氨酸，這與兩者在4種龜肉酶解液總氨基酸中的含量和百分比排序所處位置不一致，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)所用的復(fù)合蛋白酶對(duì)這兩種氨基酸的酶切位點(diǎn)有偏好性。草龜肉酶解液的賴(lài)氨酸含量最高(1.463 mg/g)，石龜肉酶解液的亮氨酸含量最高(1.349 mg/g)，而這兩種氨基酸在TFAA中的百分比均以鱷龜肉酶解液最高。石龜、草龜、花龜、鱷龜肉酶解液的FAA分別有2，3，3，2種氨基酸含量>1.0 mg/g，與TAA中含量>1.0 mg/g的氨基酸均有12種，相比較少，說(shuō)明酶解液中大部分的氨基酸以可溶性蛋白質(zhì)或短肽形式存在。

4種龜肉酶解液中游離氨基酸的EAA/TFAA(58.06%～61.06%)、EAA/NEAA(138.43%～156.91%)明顯大于其在總氨基酸中的對(duì)應(yīng)值，均高于FAO/WHO的推薦值，與鯽魚(yú)肉酶解液中的對(duì)應(yīng)值相當(dāng)，高于金槍魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)魚(yú)頭等水產(chǎn)品酶解產(chǎn)物中的對(duì)應(yīng)值[15-16]。

2.3 酶解液呈味特性和TAV分析

游離氨基酸是肉類(lèi)酶解液重要的呈味物質(zhì)，大部分有著獨(dú)特的滋味，呈現(xiàn)出甜味(Ala、Gly、His、Pro、Ser、Thr)、鮮味(Asp、Glu、Lys)以及苦味(Arg、Ile、Leu、Met、Val)，其絕對(duì)含量及相對(duì)比例會(huì)直接影響食物的鮮美程度，而一般認(rèn)為芳香族氨基酸(Phe、Tyr)無(wú)味或呈味特征不明確。

圖1 4種龜肉酶解液呈味氨基酸含量Fig.1 The content of flavor amino acids in enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

由圖1可知，在呈味氨基酸總量上，花龜肉酶解液最高，其次為草龜肉酶解液、石龜肉酶解液，鱷龜肉酶解液最低。4種龜肉酶解液中呈味氨基酸各種類(lèi)的組成比例相似，貢獻(xiàn)較大的有苦味氨基酸和鮮味氨基酸，甜味氨基酸含量較少，芳香族氨基酸最少。苦味氨基酸含量最高的為花龜肉酶解液，其次為草龜肉酶解液，石龜、鱷龜肉酶解液較少；鮮味氨基酸含量以草龜、石龜肉酶解液較高；甜味氨基酸含量最高的是花龜肉酶解液，其他幾個(gè)品種龜肉酶解液較為接近；對(duì)于芳香族氨基酸，石龜、草龜、花龜肉酶解液含量較相近，鱷龜肉酶解液略低?？傮w上，呈味氨基酸的種類(lèi)與含量與龜肉味甘、咸平的風(fēng)味特性較吻合，推測(cè)氨基酸與其風(fēng)味存在一定內(nèi)在聯(lián)系。

由于各種呈味氨基酸的味覺(jué)感知閾值不同，因此，雖然不同氨基酸在4種龜肉酶解液中的含量存在差異，但含量高的氨基酸對(duì)酶解液風(fēng)味的貢獻(xiàn)不一定大，故利用TAV對(duì)4種龜肉酶解液中的各呈味氨基酸進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)TAV<1時(shí)，表示該氨基酸對(duì)酶解液整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，TAV越大，表示其對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。

表3 4種龜肉酶解液呈味氨基酸TAV分析Table 3 The TAV of flavor amino acids in enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

續(xù) 表

由表3可知，經(jīng)過(guò)TAV變換后，在所有TAV>1的氨基酸中，除花龜肉酶解液的蛋氨酸外，4種龜肉酶解液中均有6種氨基酸TAV>1，且種類(lèi)相同，分別為谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、纈氨酸、精氨酸和苯丙氨酸，表明這6種氨基酸對(duì)龜肉酶解液的風(fēng)味有重要影響，但其對(duì)不同龜肉酶解液風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度不一?？傮w上，苦味氨基酸和鮮味氨基酸對(duì)4種龜肉酶解液的呈味特性貢獻(xiàn)較大。石龜、草龜肉酶解液中TAV最高的氨基酸是谷氨酸，其次分別為纈氨酸、精氨酸，谷氨酸在呈味氨基酸中的鮮味最強(qiáng)，是重要的鮮味劑，纈氨酸具有抑甜作用，精氨酸有提高鮮度和增加呈味復(fù)雜性的作用[17]。精氨酸是花龜肉酶解液中TAV最高的氨基酸，其次為谷氨酸。鱷龜肉酶解液中TAV最高的氨基酸是組氨酸，其次為谷氨酸，組氨酸是半必需氨基酸，有增加呈味復(fù)雜性和提升鮮度的作用，在火腿中含量較高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合蛋白酶對(duì)石龜、草龜、花龜和鱷龜肉進(jìn)行酶解，利用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)4種龜肉酶解液中的總氨基酸和復(fù)合氨基酸進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，4種龜肉酶解液的總氨基酸中均檢測(cè)到16種氨基酸，均以谷氨酸最高、蛋氨酸最低，總含量最高的為草龜肉酶解液?；敗⒉蔟?、石龜肉酶解液的EAA/TAA、EAA/NEAA與FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)較接近，表明這3種龜肉酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

4種龜肉酶解液的游離氨基酸中均含有16種氨基酸，總含量最高的是花龜肉酶解液，最低的是鱷龜肉酶解液；含量最高的游離氨基酸均為賴(lài)氨酸。4種龜肉酶解液游離氨基酸的EAA/TFAA、EAA/NEAA明顯大于其總氨基酸中的對(duì)應(yīng)值，高于部分水產(chǎn)品的酶解產(chǎn)物。呈味分析顯示，呈味氨基酸總量上以花龜肉酶解液最高，鱷龜肉酶解液最低。4種龜肉酶解液呈味氨基酸種類(lèi)的組成比例相似，均有種類(lèi)相同的6種呈味氨基酸TAV>1，但其對(duì)不同龜肉酶解液風(fēng)味的貢獻(xiàn)作用有較大差異，苦味氨基酸和鮮味氨基酸對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。本實(shí)驗(yàn)為養(yǎng)殖龜可食用部位肉的酶解產(chǎn)物作為呈味基料的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為龜肉深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)方向提供了參考。