抗凝血酶III通過SIRT1-NF-kB通路發(fā)揮腎保護(hù)作用

吳本鶴，薛 飛，張漢妤，朱 云*

（揚(yáng)州大學(xué)附屬江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225001）

膿毒癥是一種由細(xì)菌感染引發(fā)的全身擴(kuò)散性炎癥反應(yīng)，是重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)病患死亡的最主要原因，然而，目前臨床上沒有特別的治療膿毒癥的辦法。

近來研究發(fā)現(xiàn)抗凝血酶I I I 具有抗炎作用。多項(xiàng)研究[1-2]顯示，AT-III缺乏導(dǎo)致腎損傷加重。NF-kB是一種經(jīng)典的信號傳導(dǎo)通路，其可通過與Sirt1蛋白結(jié)合使TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生減少[3]。

本課題通過研究AT-III對膿毒癥腎臟炎癥因子表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究經(jīng)治療后STRI1-NF-kB通路蛋白變化，對其腎臟保護(hù)的可能機(jī)制進(jìn)行初步研究，以期為膿毒癥的治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組及方法

30只ICR小鼠購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場（生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2017-0001），體重18～22 g。將小鼠隨機(jī)分為兩組，分別為假手術(shù)組（Sham組）10只、CLP組20只。AT-III給藥量按200ug/kg計(jì)。

1.2 模型制備：

參照文獻(xiàn)[4]術(shù)式，即：麻醉小鼠后，取腹部正中切口3cm，查找并分離盲腸，于盲端處結(jié)扎，用穿刺針在結(jié)扎處遠(yuǎn)端貫穿盲腸，再將盲腸回納，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組手術(shù)方式同前，腹腔注射氯化鈉溶液2ml。

1.3 標(biāo)本采集

分別于造模后0h、6h、12h經(jīng)髂外靜脈采血2ml，將標(biāo)本靜置1h后按4500r/min離心5分鐘，取上清液，置于-80℃冰箱保存。處死大鼠，取出右側(cè)腎臟，固定于甲醛溶液中。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 膿毒癥腎損傷標(biāo)志物檢測

按照Ccr、BUN及NGAL ELISA試劑盒 (美國R&D Systems公司)說明進(jìn)行操作，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù)得到各樣品的實(shí)際濃度。

2.2 腎臟組織中炎癥因子的表達(dá)

固定腎組織，經(jīng)脫水、包埋、切片，然后再脫蠟、脫水、滅活、抗原修復(fù)，以5%胎牛血清室溫孵育1 h，分別加入兔抗大鼠TNF-a、IL-1β和IL-6多克隆一抗(稀釋比均為1：100)，4℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG二抗(稀釋比為1：1000)37℃孵育1h，然后顯色、復(fù)染、封片。200倍光學(xué)顯微鏡下，利用多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)觀察上述因子的陽性表達(dá)(棕黃色)。

2.3 Western bloting檢測NF-kB和SIRT1蛋白的表達(dá)

將腎組織研磨成勻漿，12000r／min離心15 min，蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，室溫封閉1 h，分別加入一抗稀釋液(p-NF-kB和SIRT1均為1：1 000)，4℃孵育過夜，然后用二抗稀釋液(羊抗兔二抗為1：2000)，室溫孵育1 h，用ECL顯影液顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光成像，采用Im-ageJ圖像分析軟件對圖片吸光度值進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行多樣本均數(shù)比較，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 果

4.1 血清中SCr、BUN和NGAL變化

Sham組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清Scr、BUN和NGAL濃度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在CLP組中，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)濃度隨時(shí)間延長濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CLP組與Sham組對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)比較，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、表2、表3。

表1 兩組各時(shí)間段NGAL(u/l)變化（ ±s）

表1 兩組各時(shí)間段NGAL(u/l)變化（ ±s）

時(shí)間 Sham組 CLP組 t值 P值0h 32.96±2.54 32.53±2.23 0.402 0.692 6h 32.67±2.99 102.10±2.79 -53.705 0.000 12h 32.19±2.98 132.30±2.45 -82.102 0.000 F值 0.456 2322.224 P值 0.715 0.000

表2 兩組各時(shí)間段變化Scr（umol/l）（ ±s）

表2 兩組各時(shí)間段變化Scr（umol/l）（ ±s）

時(shí)間 Sham組 CLP組 t值 P值0h 71.03±3.12 72.31±2.69 1.030 0.317 6h 73.88±3.85 86.56±4.13 -7.098 0.000 12h 73.87±4.34 95.25±6.59 -8.567 0.000 F值 1.267 645.329 P值 0.300 0.000

表3 兩組各時(shí)間段BUN（mmol/l）變化（ ±s）

表3 兩組各時(shí)間段BUN（mmol/l）變化（ ±s）

時(shí)間 Sham組 CLP組 t值 P值0h 7.50±0.36 7.20±0.35 1.893 0.075 6h 7.35±0.50 8.65±0.55 -5.510 0.000 12h 7.20±0.53 12.45±0.55 -21.789 0.000 F值 0.839 372.059 P值 0.481 0.000

4.2 腎臟組織中炎癥因子的分布

CLP組小鼠腎臟組織中炎癥細(xì)胞的表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多（P＜0.05）；使用AT-III后，各炎癥細(xì)胞的表達(dá)較CLP組顯著減少（P＜0.05）。見圖1～3。

圖1 CLP組和CLP+AT-III組大鼠腎臟組織中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）表達(dá)（棕黃色）情況。（圖中標(biāo)尺為20um）。

圖2 CLP組和CLP+AT-III組大鼠腎臟組織中白細(xì)胞介素6（IL-6）表達(dá)（棕黃色）情況。圖片標(biāo)尺為20um

圖3 CLP組和CLP+AT-III組大鼠腎臟組織中腫瘤壞死因子a（TNF-a）表達(dá)（棕黃色）情況。圖片標(biāo)尺為20um

4.3 各組乙酰化NF-kB蛋白和SIRT1蛋白的表達(dá)

CLP組中細(xì)胞表達(dá)SIRT1蛋白降低，乙酰化NF-kB蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。 AT-III可以促進(jìn)SIRT1蛋白的表達(dá)，使NF-kB乙?；浇档停≒＜0.05）。 兩組均較正常對照組比較有顯著差異（P＜0.05 ），見圖4、圖5。

5 討 論

膿毒癥(Sepsis)是由于微生物或其他病原體侵入人體而誘發(fā)的過度激烈的全身炎癥反應(yīng)，全球每年有超過1800萬的重癥病例[5]。腎臟常常是膿毒癥瀑布式炎癥反應(yīng)最常攻擊的器官之一，然而對其具體機(jī)制仍不明確。目前越來越多的證據(jù)表明，大量炎癥因子的高表達(dá)是導(dǎo)致急性腎損傷的重要原因[6]。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥模型組中，TNF-a和IL-1β、IL-6等炎癥因子表達(dá)明顯增加。因此控制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抑制細(xì)胞因子導(dǎo)致的下游炎癥信號通路的激活是治療膿毒癥腎損傷的有效手段[7]。

圖4 不同組別NF-kB p65和SIRT1蛋白表達(dá)的差異

抗凝血酶Ⅲ( antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)在人體凝血和纖溶抗凝系統(tǒng)的平衡中起著重要的作用。此外，AT-III在機(jī)體抗炎反應(yīng)中亦發(fā)揮重要的作用，對全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能功能障礙均具有治療作用。本研究中我們也觀察到，在使用AT-III治療模型組中，腎臟組織內(nèi)各炎癥因子表達(dá)明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了AT-III具有切實(shí)有效的炎癥清除能力。

NF-kB廣泛參與細(xì)胞調(diào)亡、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程[8]，NF-kB乙?；聊畔⒄{(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）能夠調(diào)控炎癥、參與氧化應(yīng)激等[9]。Sirt1可通過去乙?；cNF-kB的亞單位RelA/p65發(fā)生反應(yīng)，使影響NF-kB活性的基因表達(dá)缺失，NF-kB與核內(nèi)炎癥基因結(jié)合減少，進(jìn)而MCP-1、TNF-α等一些炎癥因子的產(chǎn)生也相應(yīng)減少。

本研究中，我們觀察到經(jīng)過AT-III治療后，腎臟組織內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)明顯增加，相應(yīng)的 NF-kB蛋白明顯下降，提示其可能通過SIRT1-NF-kB通路發(fā)揮保護(hù)作用，但仍需大量研究進(jìn)一步證實(shí)。