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    基于智能手機(jī)同時(shí)檢測(cè)4種獸藥殘留的免疫芯片技術(shù)

    2021-01-20 08:17:58范叢叢蘇曉娜沈玉棟鐘翠麗許小炫曾道平楊金易
    食品科學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:點(diǎn)樣單克隆獸藥

    吳 穎,范叢叢,蘇曉娜,沈玉棟,譚 庶,鐘翠麗,許小炫,曾道平,楊金易,*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司,廣東 云浮 527499)

    獸藥在防治動(dòng)物疾病、提高生產(chǎn)效率、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起著十分重要的作用,但部分養(yǎng)殖人員在養(yǎng)殖過程濫用獸藥,甚至使用違禁藥物、假劣藥物,造成了嚴(yán)重的獸藥殘留問題[1-5]。動(dòng)物性食物獸藥殘留在人體內(nèi)不斷的蓄積會(huì)引起人體的多種急慢性反應(yīng),如萊克多巴胺(ractopamine,RAC)和氯霉素(chloramphenicol,CAP)對(duì)人體有毒副作用,鹽酸克侖特羅(clenbuterol,CL)有致癌風(fēng)險(xiǎn),氟苯尼考(florfenicol,F(xiàn)F)具有一定的免疫毒性和胚胎毒性[6-10]。動(dòng)物源性食品中獸藥的殘留不僅直接危害著人類生命健康,同時(shí)也極大危害著畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境,已引起國(guó)際有關(guān)組織及許多國(guó)家、地區(qū)的高度重視。

    現(xiàn)階段,根據(jù)我國(guó)第176號(hào)農(nóng)業(yè)部公告,RAC禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用;根據(jù)我國(guó)第235號(hào)農(nóng)業(yè)部公告,CL及CAP在動(dòng)物性食品中不得檢出,F(xiàn)F在豬肉組織中殘留量不得超過300 μg/kg。研究表明,RAC、CL、CAP和FF在豬、牛等動(dòng)物體內(nèi)易殘留、消除緩慢,主要經(jīng)尿液排出體外[11-14]。通過檢測(cè)尿液中排出的藥物濃度,可對(duì)屠宰前動(dòng)物體內(nèi)藥物的殘留情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),對(duì)有效監(jiān)控食品安全有重要意義。

    目前,國(guó)內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于RAC、CL、CAP、FF及其代謝物氟苯尼考胺(florfenicol amine,F(xiàn)FA)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法、超高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法等。這些方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好,被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)[15-22]。但上述方法多數(shù)需要配合大儀器,且操作繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、前處理復(fù)雜,不適用于快速檢測(cè)分析。常用快速檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、膠體金免疫層析(colloidal gold immunochromatography assay,GICA)法等[23-27],這些方法或需專業(yè)人員操作、或只能檢測(cè)單一指標(biāo),無法實(shí)現(xiàn)獸藥多殘留的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)[28-29]。免疫蛋白芯片測(cè)定方法相對(duì)于以上各種方法具有低成本、高通量、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[30-33]。本實(shí)驗(yàn)利用免疫蛋白芯片技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF及其代謝物FFA的方法,同時(shí)基于智能手機(jī)開發(fā)了與免疫芯片匹配的檢測(cè)應(yīng)用程序(application,APP),適用于現(xiàn)場(chǎng)大量篩選分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    驢抗山羊血清、HRP標(biāo)記羊抗鼠血清、HRP羊抗兔血清 廣州優(yōu)抗多生物技術(shù)有限公司;RAC單克隆抗體、RAC抗原、CL單克隆抗體、CL抗原、CAP單克隆抗體、CAP抗原、FF單克隆抗體、FF抗原 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;RAC(GR,100 mg/瓶)、CL(GR,100 mg/瓶)、CAP(GR,250 mg/瓶)、FF(GR,250 mg/瓶)、FFA(GR,100 mg) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;紫色沉淀型單組分3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)顯色液湖州英創(chuàng)生物科技有限公司;P液:含10%蔗糖、0.4%魚明膠、0.5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液;T液:含8%蔗糖、0.4%魚明膠、0.5%酪蛋白的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液;PBST:含0.1% Tween-20的磷酸緩沖液。

    1.2 儀器與設(shè)備

    免疫芯片反應(yīng)盒 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;硝酸纖維素膜(NC膜) 美國(guó)Millipore公司;M227fdw多功能一體機(jī) 中國(guó)惠普有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 免疫芯片分析方法基本步驟

    本免疫芯片測(cè)定獸藥殘留的基礎(chǔ)是目標(biāo)檢測(cè)物與抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的反應(yīng)。免疫芯片上固定有藥物抗原,檢測(cè)時(shí)在反應(yīng)格加入藥物的單克隆抗體和藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品,待抗原抗體反應(yīng)后洗滌,再加入HRP標(biāo)記二抗,反應(yīng)后洗滌并加入顯色液,最后通過顯色強(qiáng)度進(jìn)行藥物定量分析?;静襟E如下:

    點(diǎn)樣包被:用碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CBS)稀釋驢抗山羊血清作為質(zhì)控點(diǎn)樣液備用,稀釋RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原作為檢測(cè)點(diǎn)樣液備用。將孔徑為0.22 μm的NC膜裁剪成合適大小,粘貼于PVC板上后置于反應(yīng)盒中,吸取點(diǎn)樣液按照0.5 cm×0.5 cm的間距點(diǎn)樣,每個(gè)樣品點(diǎn)樣量為1 μL。將點(diǎn)樣芯片置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h使蛋白質(zhì)固定在芯片上。

    封閉:包被抗原或抗體后的NC膜上尚有未被抗原或抗體填充的空隙,需對(duì)NC膜進(jìn)行封閉處理,防止非特異性吸附。將上述芯片用PBST洗滌2 次,雙蒸水洗滌1 次,反應(yīng)格中加入500 μL含1%牛血清蛋白的封閉液,于37 ℃封閉30 min。

    一抗孵育:將上述芯片用PBST洗滌2 次,雙蒸水洗滌1 次。反應(yīng)格中加入T液稀釋的單克隆抗體及標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣品液,置于搖床上反應(yīng)15 min。

    二抗孵育:將上述芯片用PBST、雙蒸水各洗滌2 次。反應(yīng)格中加入200 μL用T液稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠、HRP標(biāo)記羊抗兔混合液,置于搖床上反應(yīng)15 min。

    顯色反應(yīng):將上述芯片用PBST、雙蒸水各洗滌2 次。反應(yīng)格中加入200 μL TMB顯色液,反應(yīng)3 min,隨后將芯片取出置于潔凈濾紙,風(fēng)干后用掃描儀掃描,運(yùn)用Photoshop軟件獲取顯色斑點(diǎn)灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與智能手機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)的建立

    以確定的最佳工作質(zhì)量濃度、最佳反應(yīng)條件制備免疫芯片,以6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次,使用廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的智能手機(jī)APP“天眼測(cè)”獲取芯片顯色斑點(diǎn)灰度值與空白值(CBS點(diǎn)樣)的差值ΔI,以藥物質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo),灰度值差值ΔI作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在檢測(cè)軟件中添加獸藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目,導(dǎo)入RAC、CL、CAP、FF獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)時(shí)配合實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的圖片采集暗箱裝置,運(yùn)行檢測(cè)APP識(shí)別芯片顯色斑點(diǎn),軟件即可顯示獸藥殘留濃度并做出陰陽(yáng)性判斷。

    1.3.3 基于智能手機(jī)檢測(cè)獸藥多殘留免疫芯片分析方法的驗(yàn)證評(píng)價(jià)

    選取經(jīng)HPLC確證未被RAC、CL、CAP及FF污染的20 份豬尿樣品,離心取上清液后向其中分別添加3 種質(zhì)量濃度的RAC、CL、CAP、FF/FFA藥物標(biāo)準(zhǔn)品,采用基于智能手機(jī)免疫芯片的分析方法進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算檢測(cè)限(limit of detection,LOD),分析其添加回收率與批內(nèi)、批間變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。

    1.3.4 與其他快速檢測(cè)方法比較實(shí)驗(yàn)

    采集30 份豬尿樣品,經(jīng)前處理后向豬尿中添加不同質(zhì)量濃度的RAC、CL、CAP、FF/FFA標(biāo)準(zhǔn)品,采用基于智能手機(jī)的免疫芯片的分析方法進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)與市售膠體金免疫層析檢測(cè)卡、ELISA試劑盒檢測(cè)進(jìn)行比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NC膜孔徑、點(diǎn)樣液、抗體稀釋液的選擇及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

    NC膜固定蛋白質(zhì)的能力與其孔徑大小相關(guān),對(duì)于低分子質(zhì)量的蛋白,NC膜孔徑越小,膜結(jié)合越牢固;點(diǎn)樣稀釋液、抗體稀釋液的選擇影響抗體、抗原在液體中的分散均勻性、顯色效果,從而影響芯片檢測(cè)靈敏度;抗原包被時(shí)間影響蛋白質(zhì)固定效果及有效性;顯色反應(yīng)時(shí)間影響顯色效果,反應(yīng)時(shí)間太短則顯色不明顯,反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)易產(chǎn)生背景干擾。

    選用孔徑大小分別為0.22、0.45 μm的NC膜作為固定蛋白質(zhì)的載體制備檢測(cè)單種獸藥殘留的免疫蛋白芯片,選用CBS和PBS作為點(diǎn)樣稀釋液稀釋驢抗羊血清與抗原,選用P液、T液、PBS作為抗體稀釋液稀釋單克隆抗體,選擇0.5、1、2、8 h作為包被時(shí)間固定蛋白質(zhì),選擇1、3、5、10、20 min作為顯色時(shí)間進(jìn)行顯色反應(yīng),觀察芯片顯色效果與檢測(cè)靈敏度。結(jié)果顯示,當(dāng)使用0.22 μm的NC膜作為蛋白固定載體、CBS作為點(diǎn)樣稀釋液、T液作為抗體稀釋液時(shí),顯色反應(yīng)后芯片背景干擾較少、點(diǎn)樣斑點(diǎn)形狀較規(guī)則、顯色較均勻、靈敏度較高;當(dāng)包被時(shí)間為1 h(37 ℃)時(shí)芯片對(duì)蛋白固定量最大,斑點(diǎn)顯色最深;顯色反應(yīng)時(shí)間3 min時(shí)斑點(diǎn)顯色明顯,背景干擾較少。

    2.2 抗原、抗體最佳工作質(zhì)量濃度的優(yōu)化

    抗原、抗體的工作質(zhì)量濃度影響芯片顯色效果與檢測(cè)靈敏度,隨著點(diǎn)樣抗原與抗體質(zhì)量濃度的增高,芯片斑點(diǎn)顯色越深,灰度值越高,藥物與抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的反應(yīng)越不明顯,靈敏度越低。使用棋盤法優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)中抗原、抗體的最佳工作質(zhì)量濃度,各抗原、抗體稀釋倍數(shù)如表1所示。

    表1 各抗原、抗體稀釋倍數(shù)的確定Table 1 Determination of optimal dilution factors of coating antigens and monoclonal antibodies

    在綜合檢測(cè)斑點(diǎn)顯色強(qiáng)度、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)靈敏度、原料用量的基礎(chǔ)上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原最佳稀釋倍數(shù)為1∶1 000、1∶500、1∶2 500、1∶100,RAC抗體、CL抗體、CAP抗體、FF抗體最佳稀釋倍數(shù)分別為1∶30 000、1∶400 000、1∶300 000、1∶200 000。在最優(yōu)反應(yīng)條件下,免疫芯片對(duì)RAC、CL、CAP、FF的檢測(cè)靈敏度分別為2、2、0.5、50 ng/mL。免疫芯片檢測(cè)不同質(zhì)量濃度RAC的結(jié)果如圖1所示(CL、CAP、FF檢測(cè)結(jié)果圖類似不再列出)。

    圖1 免疫芯片分析RAC殘留的檢測(cè)靈敏度Fig. 1 Sensitivity of immunochip assay for RAC

    2.3 抗體特異性與交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)

    當(dāng)4 種檢測(cè)項(xiàng)目集成于同一免疫芯片時(shí),4 種檢測(cè)對(duì)象的抗原-抗體-藥物之間特異性影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)的原理,對(duì)抗原-抗體-藥物之間的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。以確定的最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將免疫芯片裁剪成2.5 cm×0.5 cm,吸取質(zhì)控、檢測(cè)點(diǎn)樣液按照5×1(驢抗山羊血清、RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原)陣式點(diǎn)樣,其余步驟如1.3.1節(jié),其中一抗孵育時(shí)1~4號(hào)點(diǎn)樣芯片所在反應(yīng)格中分別加入RAC單克隆抗體、CL單克隆抗體、CAP單克隆抗體、FF單克隆抗體和緩沖溶液,5~8號(hào)點(diǎn)樣芯片所在反應(yīng)格中加入4 種藥物單克隆抗體的混合液及RAC、CL、CAP、FF單種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    從圖2a可知,使用包被了驢抗羊血清及多種藥物抗原的免疫芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn),當(dāng)一抗孵育只加入一種單克隆抗體及緩沖液時(shí),只有質(zhì)控區(qū)及該單克隆抗體對(duì)應(yīng)的抗原包被區(qū)顯現(xiàn)斑點(diǎn),其余抗原包被區(qū)不顯現(xiàn)斑點(diǎn),說明該實(shí)驗(yàn)中一種單克隆抗體只與驢抗羊血清及其所對(duì)應(yīng)的抗原產(chǎn)生特異性結(jié)合,不與其余3 種藥物抗原發(fā)生明顯特異性結(jié)合。從圖2b可看出,當(dāng)一抗孵育只加入混合抗體及單種藥物標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),只有該藥物對(duì)應(yīng)檢測(cè)區(qū)不顯現(xiàn)斑點(diǎn),說明一種藥物只特異性抑制對(duì)應(yīng)藥物抗原與其單克隆抗體的結(jié)合,對(duì)其余3 種藥物抗原與其對(duì)應(yīng)抗體的結(jié)合無明顯抑制。由此可知,各抗體對(duì)其抗原的特異性較好,同時(shí)檢測(cè)4 種獸藥殘留時(shí)各對(duì)象的檢測(cè)無明顯干擾。

    圖2 抗體特異性分析(a)和各分析物交叉反應(yīng)(b)結(jié)果Fig. 2 Evaluation of antibody specificity (a) and cross-reactivities between analytes (b)

    2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    以藥物質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)、灰度值差值ΔI作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線方程及免疫芯片檢測(cè)4 種獸藥殘留的分析參數(shù)如表2所示,該方法對(duì)RAC、CL、CAP、FF的檢出限(20 份空白樣品平均值與3 倍標(biāo)準(zhǔn)差的和)分別為0.146、0.137、0.035、3.7 3 n g/m L,線性范圍(I C20~I(xiàn) C80)分別為0.35 3 ~1.0 17、0.309~0.897、0.082~0.249、9.424~35.594 ng/mL,相關(guān)系數(shù)大于0.99。

    表2 免疫芯片檢測(cè)4 種獸藥殘留的分析參數(shù)Table 2 Figures of merit of the immunochip assays for the detection of four veterinary drugs

    使用本方法測(cè)出FFA的IC50,計(jì)算交叉反應(yīng)率(交叉反應(yīng)率/%=IC50(FF)/IC50(FFA)×100)。結(jié)果顯示IC50(FFA)為22.465 ng/mL,交叉反應(yīng)率為81.5%。說明該方法可同時(shí)檢測(cè)FF與FFA。

    2.5 基于智能手機(jī)檢測(cè)獸藥多殘留免疫芯片分析方法的準(zhǔn)確度、精密度

    使用20 份豬尿樣品進(jìn)行藥物添加檢測(cè),回收率與CV如表3所示,添加回收率在85.69%~110.66%之間,批內(nèi)CV不高于12.53%,批間CV小于15%。由此可見,本方法具有良好的回收率,可同時(shí)檢測(cè)豬尿樣品中RAC、CL、CAP、FF/FFA的殘留量。

    表3 豬尿中各藥物回收率和CV值Table 3Recoveries and inter-batch and intra-batch coefficients of variation of four veterinary drugs spiked into pig urine samples

    2.6 與其他快速檢測(cè)方法比較結(jié)果

    使用基于智能手機(jī)的免疫芯片法、GICA、ELISA法檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF/FFA殘留量,檢測(cè)結(jié)果如表4所示,免疫芯片法與市售膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果的符合率為99.2%、與ELISA法檢測(cè)結(jié)果的符合率為98.3%,說明本方法與常用快速檢測(cè)方法相比有較高的符合性,可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF/FFA的殘留量。

    表4 免疫芯片法與GICA法、ELISA試劑盒法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 4 Comparison of results of detection using immunochip assay,GICA and ELISA

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)研制了基于智能手機(jī)檢測(cè)多種獸藥的免疫芯片,能同時(shí)檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF及其代謝物FFA。該方法對(duì)RAC、CL、CAP、FF的檢出限分別為0.146、0.137、0.035、3.73 ng/mL,線性范圍分別為0.353~1.017、0.309~0.897、0.082~0.249、9.424~35.594 ng/mL。豬尿中藥物添加回收率為85.69%~110.66%,批內(nèi)CV不高于12.53%,批間CV小于15%,與GICA和ELISA兩種傳統(tǒng)快速檢測(cè)方法相比檢測(cè)符合率大于98%,是一種方便快速、高通量、低成本檢測(cè)多種獸藥殘留的方法,適用于現(xiàn)場(chǎng)大量篩選分析。

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