基于iTRAQ 技術(shù)分析牛初乳與常乳乳清差異蛋白質(zhì)組

鄧 微，李韞同，李墨翰，曹雪妍，鄭 艷，武俊瑞，岳喜慶，楊 梅

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

牛乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括人體所需的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)等成分，是人類膳食中非常重要的部分。牛乳除了能夠?yàn)槿梭w提供足夠的營(yíng)養(yǎng)成分，還會(huì)供給生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)具有提高人體免疫力、調(diào)節(jié)胃腸道健康以及抵抗病毒等作用[1]。牛初乳中含有豐富的免疫活性物質(zhì)以及非特異性抗菌物質(zhì)，對(duì)新生兒至關(guān)重要，能夠?yàn)槠涮峁┑挚垢腥镜姆烙芰2-3]、促進(jìn)胃腸道組織生長(zhǎng)發(fā)育以及存進(jìn)機(jī)體功能成熟[4]的作用，具有“免疫之王”和“乳黃金”之稱。

蛋白質(zhì)是牛乳中最主要的成分之一，大約占牛乳的3.5%，而乳脂肪球膜蛋白、酪蛋白、乳清蛋白是牛乳蛋白的主要成分，其中乳清蛋白占牛乳總蛋白的20%左右。乳清蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，相對(duì)于酪蛋白，乳清蛋白更容易被人體消化吸收，是人體所需的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑[5-6]。乳清蛋白含有豐富的免疫球蛋白、乳鐵蛋白以及一些小分子活性肽，因此被廣泛應(yīng)用在嬰幼兒乳制品、功能性食品以及特需食品中[7-10]。近年來關(guān)于牛乳乳清蛋白的研究更是越來越多，研究者們利用先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，闡明了不同乳源乳清蛋白質(zhì)組成，并找到了差異表達(dá)蛋白[11-13]。對(duì)于乳制品工業(yè)而言，牛乳產(chǎn)量大、應(yīng)用廣，是目前生產(chǎn)乳制品最主要的原料之一，因此發(fā)現(xiàn)其中重要的功能活性成分，并應(yīng)用到乳制品中，具有重要意義。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，大規(guī)模的蛋白質(zhì)定量技術(shù)不斷應(yīng)用在乳制品中，并得了一些進(jìn)展[14-18]，然而，大規(guī)模的不同泌乳期牛乳的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究還鮮有報(bào)道。

本研究利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探究了牛初乳與牛常乳乳清蛋白豐度差異，利用生物信息學(xué)方法，分析了牛初乳與牛常乳乳清豐度差異蛋白的功能，為生產(chǎn)和提高牛乳產(chǎn)品品質(zhì)、研發(fā)嬰幼兒乳粉及功能性食品的生產(chǎn)提供重要信息和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳來自于沈陽(yáng)輝山乳業(yè)牧場(chǎng)，為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，樣品選自年齡均為1～3 歲之間健康的黑白花奶牛，飼養(yǎng)與管理?xiàng)l件均一致。初乳（0～3 d）、常乳（1～6 個(gè)月）的樣品各采集自60 頭奶牛。采集后的樣品立即放入冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，并在超低溫冰箱中-80 ℃貯藏備用。實(shí)驗(yàn)前，將牛初乳與牛常乳分別混合，其目的為排除個(gè)體性差異。

二硫蘇糖醇（dithiotheritol，DTT）、十二烷基硫酸鈉、尿素、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris） 美國(guó)Bio-Rad公司；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶、iTRAQ 8標(biāo)試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、色譜級(jí)甲酸、色譜級(jí)乙腈、30 kDa超濾離心管 美國(guó)Sigma公司；C18固相萃取小柱美國(guó)Waters公司；鹽酸、氯化鈣、氯化鈉（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；微量移液器、真空離心濃縮儀、5910R低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；AKTA Purifier 100純化儀美國(guó)GE Healthcare公司；WFZ UV-2100可見-紫外分光光度計(jì) 美國(guó)尤尼柯公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 賽多利斯集團(tuán)公司；真空冷凍干燥機(jī) 磐豐干燥設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳乳清蛋白的制備

樣品于-80 ℃冰箱取出，4 ℃溶解。各取50 mL樣品于離心管中，在4 ℃、8 000×g離心20 min。小心移去上次乳脂肪，剩余的脫脂乳置于新的離心管中，加入10 mL的PBS清洗3 次，每次超聲1 次（60 W，20 s），4 ℃、80 000×g離心60 min，收集下層脫脂乳樣品。中層和下層樣品繼續(xù)4 ℃、120 000×g離心60 min，收集上清乳清樣品。加入5 倍體積的預(yù)冷丙酮，充分溶解，-18 ℃冷卻過夜。并于4 ℃、100 000×g離心20 min，收集蛋白質(zhì)沉淀，此步驟重復(fù)3 次，得到乳清蛋白，利用Bradford試劑盒測(cè)定乳清蛋白含量[19]。

1.3.2 牛乳乳清蛋白的胰蛋白酶酶解及iTRAQ標(biāo)記

根據(jù)牛乳乳清蛋白質(zhì)濃度測(cè)定結(jié)果，分別取樣品（牛初乳、牛常乳）提取的乳清蛋白500 μg，向樣品中加入一定量的緩沖液A（0.1 mol/L NH4HCO3、pH 8.0 0.1 mol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素），加入DTT將終濃度調(diào)整為10 mmol/L，并與37 ℃條件下，孵育120 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。向混合溶液中加入IAA調(diào)整濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)45 min。加入一定量的水，將B緩沖液A的濃度稀釋至1.5 mol/L，按照1∶50的比例添加測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，并于37 ℃條件下反應(yīng)20 h，最終牛乳乳清蛋白酶解液利用C18進(jìn)行脫鹽處理，并與OD280nm肽段進(jìn)行定量[20]。取200 μg的乳清蛋白酶解肽段，利用iTRAQ試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的肽段在室溫下孵育60 min。

1.3.3 毛細(xì)管高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定

每份樣品采用nL流速HPLC液相系統(tǒng)進(jìn)行牛乳乳清蛋白肽段分離。緩沖液：A液選擇0.1%甲酸溶液，B 液選擇0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84%）。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到C18（2 cm×100 μm，5 μm），再經(jīng)分析柱C18（75 μm×100 mm，3 μm）分離，流速控制為300 nL/min。梯度洗脫程序：0～50 min，96%～50% A，4%～50% B；50～54 min，50%～0% A，50%～100% B；54～60 min，0% A，100% B。

每份牛乳乳清蛋白標(biāo)記肽樣品經(jīng)毛細(xì)管HPLC分離后利用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)為60 min，利用+離子檢測(cè)，母離子掃描范圍控制在m/z300～1 800。質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)存為RAW文件，用軟件Mascot 2.2結(jié)合Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行查庫(kù)鑒定及牛乳乳清蛋白酶解肽段定量分析。原始文件用Proteomics Tools分析軟件抽提肽段報(bào)告離子峰定量信息，并以牛初乳組為內(nèi)參對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化分析處理，以軟件計(jì)算的各肽段比值的加權(quán)平均值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果。查庫(kù)時(shí)將儲(chǔ)存的RAW文件利用Proteome Discoverer軟件提交至Mascot 2.2服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫(kù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。利用Proteome Discoverer 1.4軟件對(duì)牛乳乳清蛋白酶解肽段報(bào)告離子峰的強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析[21]。

1.4 牛乳乳清蛋白的生物信息學(xué)分析

為確定蛋白的功能，利用在線DAVID在線數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），分析乳清豐度差異蛋白的基因功能注釋（gene ontology，GO）和關(guān)鍵詞。利用STRING分析軟件（https://string-db.org/）探究不同泌乳期牛乳乳清豐度差異蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳乳清質(zhì)譜鑒定

將iTRAQ標(biāo)記后牛初乳、牛常乳乳清蛋白酶解混合肽段進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子柱分離，為保證鑒定蛋白數(shù)量，采用分級(jí)的方式進(jìn)行收集肽段，結(jié)果如圖1所示。

圖1 牛乳乳清蛋白酶解肽段SCX色譜圖Fig. 1 SCX chromatogram of peptides derived from enzymatic hydrolysis of milk whey proteins

牛乳乳清蛋白酶解肽段利用SCX分級(jí)并進(jìn)行脫鹽后的樣品利用質(zhì)譜分析，然后數(shù)據(jù)利用Mascot查庫(kù)。結(jié)果合并后根據(jù)Peptide FDR≤0.01進(jìn)行篩選過濾。最終鑒定到2 810 個(gè)肽段，通過對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)，在不同泌乳期牛乳乳清中共鑒定到599 種蛋白，其中在牛初乳與牛常乳中找到60 種乳清豐度差異蛋白（P＜0.05），如圖2所示。雖然牛常乳與牛常乳乳清蛋白具有一定的相似性，但是在豐度上存在一定的差異。Golinelli等[22]利用2-DE在初乳中鑒定到20 個(gè)點(diǎn)，在牛常乳中鑒定到18 個(gè)點(diǎn)。Yang Mei等[23]利用iTRAQ研究了人乳與牛乳差異表達(dá)乳清蛋白，并找到了乳清蛋白的功能差異。Senda等[24]利用2-DE技術(shù)在牛乳乳清中鑒定到25 種蛋白。Yang Yongxin等[25]利用iTRAQ標(biāo)記的方法在人常乳與牛常乳中鑒定到了211 種乳清蛋白，并找到了133 種差異表達(dá)蛋白。Le等[26]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在牛初乳乳清中鑒定到253 種蛋白，在牛常乳乳清中鑒定到257 種蛋白。對(duì)比之前的研究，本實(shí)驗(yàn)鑒定到了更多的牛乳乳清蛋白并獲得了更多的定量信息，這些蛋白可能是牛乳乳清中重要的生物活性成分。

圖2 牛初乳與常乳乳清差異表達(dá)蛋白熱圖Fig. 2 Hierarchical clustering heat map of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

在這些豐度差異蛋白中，與牛常乳相比，在牛初乳中存在25 種上調(diào)表達(dá)蛋白，35 種下調(diào)表達(dá)蛋白。這些不同泌乳期牛乳乳清差異蛋白中，糖基化依賴性細(xì)胞黏附分子1（登錄號(hào)：P80195）、α-乳白蛋白（登錄號(hào)：Q9TSR4）、乳過氧化物酶（登錄號(hào)：A5JUY8）、蛋白激酶c結(jié)合蛋白NELL2（登錄號(hào)：H0YI34）、基質(zhì)依賴磷酸鹽運(yùn)輸?shù)鞍?B（登錄號(hào)：F1N6D4）在牛常乳中均表現(xiàn)出高表達(dá)水平（牛常乳乳清蛋白表達(dá)量均大于牛初乳乳清蛋白的5 倍以上）。這些高豐度的牛常乳乳清蛋白的發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)橐耘Ｈ榍宓鞍诪榛仙a(chǎn)功能性食品及特需食品提供理論依據(jù)。免疫球蛋白IgG輕鏈（登錄號(hào)：Q6GMX4）、MHC I類抗原（登錄號(hào)：Q860J9）、Ig重鏈的可變區(qū)（登錄號(hào)：A2P2H9）、肌萎縮蛋白1（登錄號(hào)：A0A024R2W4）、Igλ-1 C鏈（登錄號(hào)：L8IAF4）在牛初乳乳清蛋白中均表現(xiàn)出高表達(dá)水平（牛初乳乳清蛋白表達(dá)量均大于牛常乳乳清蛋白的5 倍以上）。這些牛初乳乳清高表達(dá)量蛋白主要是與免疫相關(guān)的蛋白。牛初乳中高表達(dá)量蛋白的發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)閶胗變号浞饺榉鄣纳a(chǎn)以及功能性食品提供重要信息。

2.2 乳清豐度差異蛋白的GO功能注釋分析

GO功能注釋包括生物過程、分子功能及分子組成。本研究將牛初乳與牛常乳乳清豐度差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 牛初乳與牛常乳乳清差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋Fig. 3 GO annotation of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

通過牛初乳與牛常乳乳清豐度差異蛋白的GO功能注釋分析可知，乳清差異蛋白主要參與的生物過程為轉(zhuǎn)運(yùn)、定位、單一生物作用、生物質(zhì)量調(diào)節(jié)、以及紙質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與定位；主要參與的分子功能為頂端質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞外區(qū)域空間以及膜結(jié)合細(xì)胞器；主要參與的細(xì)胞組成為蛋白結(jié)合和陰離子結(jié)合。將差異蛋白通過GO功能注釋能夠進(jìn)一步了解這些差異蛋白的功能作用。牛初乳與牛常乳乳清差異蛋白在機(jī)體中豐度的上調(diào)與下調(diào)均會(huì)影響到一些生物調(diào)控作用。Liao等[27]利用GO功能注釋分析了不同泌乳期人乳乳清差異蛋白主要參與了信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外組成、代謝等過程。Yang Yongxin等[28]利用iTRAQ技術(shù)分析了不同物種牛乳、駱駝乳、羊乳、水牛乳的乳清差異蛋白，并將差異蛋白利用GO功能注釋進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同哺乳動(dòng)物乳乳清豐度差異蛋白主要參與的生物過程為生物調(diào)節(jié)；主要參與的分子功能為蛋白結(jié)合；參與細(xì)胞組成為細(xì)胞內(nèi)部分。因此，找到這些差異表達(dá)蛋白對(duì)深入認(rèn)識(shí)牛初乳與牛常乳乳清蛋白具有重要作用，為日后生產(chǎn)特定功能的乳清蛋白制品提供重要理論依據(jù)。

2.3 乳清豐度差異蛋白分析

圖4 牛初乳與牛常乳乳清蛋白關(guān)鍵詞Fig. 4 Key words about bovine whey proteins in bovine colostrum and mature milk

表1 牛初乳與牛常乳乳清與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的豐度差異蛋白Table 1 Signal transduction-related differential abundant whey proteins between bovine colostrum and mature milk

表2 牛初乳與牛常乳乳清糖基化豐度差異蛋白Table 2 Differential abundant glycoproteins between bovine colostrum and mature milk

由圖4可知，牛初乳與牛常乳乳清差異表達(dá)蛋白中有9 種蛋白與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)、6 種糖基化蛋白、5 種分泌型蛋白、5 種具有二硫鍵蛋白、2 種溶酶體蛋白以及2 種為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。表1為不同泌乳期牛乳乳清與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的豐度差異蛋白，在信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)差異蛋白中，有3 種蛋白在牛初乳乳清中豐度上調(diào)，6 種蛋白豐度下調(diào)。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白在機(jī)體內(nèi)與代謝途徑相關(guān)，因此，這些蛋白豐度的上調(diào)或者下調(diào)均會(huì)影響機(jī)體的生物反應(yīng)[29]。表2為牛初乳與牛常乳乳清差異表達(dá)糖基化蛋白，在這些糖基化差異蛋白均在牛常乳中豐度上調(diào)。并且，附睪分泌蛋白E1、糖基化依賴性細(xì)胞黏附分子1、上皮黏蛋白、前列腺素蛋白還與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，這些蛋白可能在機(jī)體中具有重要的生物學(xué)功能。這也說明，一種蛋白在機(jī)體內(nèi)具有多重作用與功能。Cao Xueyan等[30-32]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了人乳與牛乳乳脂肪球膜、乳清中糖基化位點(diǎn)的差異，找到了牛乳中糖基化蛋白，并分析了這些糖基化蛋白的功能。本研究通過對(duì)牛初乳、牛常乳乳清差異豐度蛋白的關(guān)鍵詞進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了與重要生物學(xué)功能相關(guān)的蛋白，這些蛋白有的在牛初乳中豐度上調(diào)，有的在牛初乳中豐度上調(diào)。因此，這些具有重要生物學(xué)功能蛋白的發(fā)現(xiàn)，能夠?yàn)楣δ苄允称芳叭橹破返纳a(chǎn)與研發(fā)提供重要信息。

2.4 乳清豐度差異蛋白的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析

在機(jī)體中，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用以及相互作用是蛋白質(zhì)彼此之間傳遞信號(hào)和相互調(diào)節(jié)行使其功能與作用的基礎(chǔ)。因此，本研究將牛初乳、牛常乳乳清豐度差異蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析，對(duì)于揭示牛乳乳清蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能并找到具有關(guān)鍵蛋白具有重要意義，結(jié)果如圖5所示。在60 種牛初乳與牛常乳乳清差異表達(dá)蛋白中，有14 種蛋白在String數(shù)據(jù)庫(kù)中被收錄，通過分析發(fā)現(xiàn)有10 種蛋白的17 種相互作用。其中，具有高連接度的為黃嘌呤脫氫酶/氧化酶、免疫球蛋白λ樣多肽1。黃嘌呤氧化酶的功能主要是參與機(jī)體內(nèi)核酸的分解代謝以及促進(jìn)鐵的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。免疫球蛋白λ樣多肽1主要會(huì)影響機(jī)體對(duì)乳脂的合成代謝[34]。因此，這些高連接度的牛乳乳清差異蛋白很可能是調(diào)節(jié)整個(gè)系統(tǒng)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，具有非常重要的作用。

圖5 牛初乳與牛常乳乳清差異蛋白的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Protein-protein interaction networks of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

3 結(jié) 論

本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)先進(jìn)技術(shù)，對(duì)牛初乳、牛常乳乳清蛋白的組成及豐度差異進(jìn)行了鑒定與分析。在599 種鑒定的具有定量信息的乳清蛋白中，發(fā)現(xiàn)了60 種差異豐度乳清蛋白。與牛常乳相比，牛初乳中存在25 種豐度上調(diào)表達(dá)蛋白，35 種豐度下調(diào)表達(dá)蛋白，說明牛初乳與牛常乳在蛋白質(zhì)豐度上存在較大差異。通過GO功能注釋、功能關(guān)鍵詞、蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作等生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要參與的生物過程為轉(zhuǎn)運(yùn)；主要參與的分子功能為頂端質(zhì)膜；主要參與的細(xì)胞組成為蛋白結(jié)合。并找到了9 種與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的乳清差異蛋白，以及具有高連接度的黃嘌呤氧化酶與免疫球蛋白λ樣多肽1。本研究對(duì)牛初乳與常乳乳清蛋白豐度的差異進(jìn)行了深入研究，找到了重要的功能性蛋白，這些蛋白的發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)槿蘸笊a(chǎn)及優(yōu)化功能性乳制品提供理論依據(jù)。