基于SPME-GC-MS 分析不同烤制時(shí)間新疆烤羊腿表層及內(nèi)層揮發(fā)性化合物

丁 丹，王松磊，羅瑞明，王永瑞，柏 霜，沈 菲，柏 鶴

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

新疆烤羊腿是我國(guó)傳統(tǒng)燒烤肉制品的典型代表，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。肉制品中的揮發(fā)性化合物對(duì)其整體風(fēng)味起著決定性作用，是評(píng)價(jià)肉制品風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)，因此對(duì)烤羊腿中揮發(fā)性化合物進(jìn)行研究十分重要[2]。謝建春等[3]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在不同烤制階段，羊腿中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物會(huì)發(fā)生脂肪氧化、美拉德反應(yīng)產(chǎn)生各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)烤羊腿的風(fēng)味產(chǎn)生重要的影響。馬建榮等[4]研究了不同烤制技術(shù)對(duì)烤羊腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。發(fā)現(xiàn)電烤技術(shù)更有利于烤羊腿揮發(fā)性風(fēng)味化合物形成，過(guò)熱蒸汽烤羊腿的風(fēng)味更接近傳統(tǒng)馕烤。Jeremiah[5]研究發(fā)現(xiàn)不同地域的烤羊腿由于羊的品種、相關(guān)遺傳因素及加工方式的不同導(dǎo)致風(fēng)味特征存在差異。目前針對(duì)烤羊腿在烤制過(guò)程中由于表層和內(nèi)層受熱程度不同所導(dǎo)致的表層易產(chǎn)生焦糊味，內(nèi)層風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生不足的問(wèn)題鮮有研究。

鑒于此，本研究通過(guò)固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用法對(duì)新疆烤羊腿表層和內(nèi)層在烤制過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物進(jìn)行對(duì)比鑒定分析。同時(shí)采用氣味活性化合物分析，對(duì)新疆烤羊腿烤制過(guò)程中表層和內(nèi)層特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)氣味活度值進(jìn)行跟蹤分析，探討其基本變化規(guī)律，為烤羊腿風(fēng)味評(píng)價(jià)提供重要參數(shù)，為烤羊腿的烤制工藝優(yōu)化及品質(zhì)控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊腿均為9月齡、體質(zhì)量（30±1）kg的新疆哈薩克公羊后腿，由新疆阿爾曼食品有限公司提供。

1,2-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Qp2010ultra 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本Shimadzu公司；PK157330-U型手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；DB-WAX型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國(guó)Agilent公司；WNB22型精密數(shù)顯恒溫水浴槽 上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；ST658型紅外測(cè)溫儀 廣州市俊凱電子科技有限公司；WZPB型熱電偶 天康股份有限公司；ZBS-ZNKX型智能雙層四盤(pán)烤箱 東莞市深業(yè)廚具有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取分別在電烤箱內(nèi)（烤制溫度設(shè)置為上火180 ℃，下火200 ℃）烤制0.5、1、1.5、2、2.5、3 h的羊腿表層（羊腿皮下脂肪部分）及內(nèi)層（去除皮下脂肪的肌肉部分）分別用組織搗碎機(jī)攪碎備用。每組樣本做3 個(gè)平行。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 風(fēng)味物質(zhì)萃取

準(zhǔn)確稱?。?.00±0.01）g樣品置于15 mL頂空瓶中，加入2 μL質(zhì)量濃度為95.1 μg/μL的1,2-二氯苯作為內(nèi)標(biāo)[6]。用聚四氟乙烯隔膜將頂空瓶口密封，置于60 ℃恒溫水浴鍋加熱20 min后將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，再于60 ℃恒溫水浴鍋吸附30 min。將吸附后的萃取頭取出插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)[7]。

1.3.2.2 GC-MS聯(lián)用分析條件

GC條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；起始溫度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升溫到90 ℃，再以8 ℃/min升溫到230 ℃保持10 min，載氣為He，恒定流速為1.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃[8]。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 20～350。掃描方式：全掃描；溶劑延遲3 min；調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

1.3.2.3 定性與定量分析

揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)色譜柱分離后，化合物由質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NIST、標(biāo)準(zhǔn)化合物保留指數(shù)（retention index，RI）以及香氣特征對(duì)比鑒定。根據(jù)已知質(zhì)量濃度的1,2-二氯苯的峰面積計(jì)算測(cè)得烤羊腿樣品中揮發(fā)性物質(zhì)總量。

1.3.3 風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)價(jià)

用氣味活度值（odor activity value，OAV）評(píng)價(jià)各香氣組分對(duì)新疆烤羊腿表層和內(nèi)層香味的貢獻(xiàn)，OAV為各香氣組分的濃度（C）與感覺(jué)閾值（T）的比值：OAV=C/T。當(dāng)OAV＜1時(shí)，該物質(zhì)對(duì)總體香味無(wú)影響作用；當(dāng)OAV＞1時(shí)，說(shuō)明該物質(zhì)可能直接影響著總體香味；在一定范圍內(nèi)，OAV越大說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。

采用峰面積歸一化法計(jì)算得到的揮發(fā)性香氣組分的濃度為相對(duì)濃度，用相對(duì)濃度代替絕對(duì)濃度。將OAV最大的香氣組分作為標(biāo)準(zhǔn)，其他組分的OAV與之相比，進(jìn)而定義新參數(shù)為相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV），即各化合物的ROAVi為各香氣組分的OAVi與OAVmax的香氣組分的比值[9-10]。

所有香氣組分的ROAV在0～100之間，并且ROAV越大說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)產(chǎn)品的整體香味貢獻(xiàn)較大。ROAV＞1的組分為關(guān)鍵香味化合物，0.1＜ROAV＜1的組分為修飾風(fēng)味化合物，ROAV＜0.1的組分為潛在風(fēng)味化合物[11]。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

1.3.4.1 感官分析人員的篩選和培訓(xùn)

感官評(píng)定實(shí)驗(yàn)小組人員由經(jīng)培訓(xùn)、篩選后的5 名男生5 名女生組成（年齡均在22～24 歲且具有一定食品專(zhuān)業(yè)背景的研究生）。篩選與培訓(xùn)方法參照GB/T 16291.2—2010《感官分析 選拔、培訓(xùn)和管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則》[12]。對(duì)合格的感官評(píng)定人員進(jìn)行熟悉感官術(shù)語(yǔ)及反復(fù)嗅覺(jué)評(píng)價(jià)的培訓(xùn)[13]。

1.3.4.2 感官評(píng)定

感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在感官品評(píng)實(shí)驗(yàn)室完成，將烤羊腿表層及內(nèi)層分別切分成大小均勻的方塊，用量相同放入潔凈托盤(pán)中。對(duì)不同烤制時(shí)間烤羊腿表層和內(nèi)層樣品進(jìn)行編碼，在相同白熾燈照明條件下呈給感官評(píng)定人員[14]。感官評(píng)定人員按烤羊腿的香氣評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。根據(jù)文獻(xiàn)[15]以及聽(tīng)取烤肉師傅的建議，對(duì)烤羊腿香氣的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)劃分為4 個(gè)等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)采用描述檢驗(yàn)法與情感檢驗(yàn)法對(duì)烤羊腿香氣品質(zhì)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

表1 烤羊腿的香氣評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for aroma evaluation of roast lamb leg

1.3.5 烤羊腿表層及內(nèi)層溫度測(cè)定

保證烤制過(guò)程中室溫恒定，每隔0.5 h打開(kāi)烤箱門(mén)迅速使用紅外測(cè)溫儀檢測(cè)肉樣本表層溫度（平行測(cè)定3 次取平均值）測(cè)定完后立即關(guān)閉烤箱門(mén)。內(nèi)層溫度插入熱電偶測(cè)量，每隔0.5 h記錄1 次。（由于實(shí)驗(yàn)所用羊腿皮下脂肪最大厚度為1.5 cm，所以假設(shè)表層下1.5 cm處肌肉溫度即為內(nèi)層溫度）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin 8.6軟件（Origin Lab公司）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤制時(shí)間對(duì)烤羊腿表層和內(nèi)層香氣感官評(píng)分的影響

表2 不同烤制時(shí)間烤羊腿表層和內(nèi)層香氣感官評(píng)分Table 2 Sensory evaluation scores for aroma in the surface and inner layers of roast lamb leg at different roasting time points

如表2所示，不同烤制時(shí)間下烤羊腿表層和內(nèi)層香氣感官評(píng)分均具有顯著的差異性?？局茣r(shí)間為2 h的烤羊腿表層和內(nèi)層香味表現(xiàn)為烤香味濃且無(wú)焦苦味感官評(píng)價(jià)得分最高?？局茣r(shí)間為0.5 h的內(nèi)層和3 h的表層感官評(píng)價(jià)得分最低，可能是由于烤制0.5 h的內(nèi)層溫度較低，一些能夠產(chǎn)生香氣物質(zhì)的反應(yīng)未能發(fā)生，使得0.5 h的內(nèi)層無(wú)烤香味。而烤制3 h的表層溫度已達(dá)到140 ℃以上極易發(fā)生焦糊化使表層的焦苦味過(guò)濃[17]。

2.2 烤制時(shí)間對(duì)烤羊腿表層和內(nèi)層溫度的影響

表3 不同烤制時(shí)間烤羊腿表層和內(nèi)層溫度（n=3）Table 3 Temperatures of the surface and inner layer of roast lamb leg at different roasting time points (n= 3)

如表3所示，烤羊腿表層和內(nèi)層溫度隨烤制時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。內(nèi)層溫度上升速度低于表層，且在烤制過(guò)程中溫度始終低于100 ℃。烤制1.5 h時(shí)烤羊腿的內(nèi)層溫度大于75 ℃，此時(shí)在保證羊腿成熟的同時(shí)羊腿中大多數(shù)微生物被殺死[16]?？局?.5 h時(shí)烤羊腿表層溫度達(dá)到130 ℃以上此時(shí)油水散失基本停止層接近干制狀態(tài)[17]。

2.3 烤制時(shí)間對(duì)烤羊腿表層和內(nèi)層揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)及含量的影響

采用SPME-GC-MS分析不同烤制時(shí)間烤羊腿表層及內(nèi)層揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)譜結(jié)果，通過(guò)對(duì)比NIST譜庫(kù)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

如表4、5 所示，表層的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有64 種，內(nèi)層共有55 種。主要為烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)和苯酚類(lèi)。從化合物的種類(lèi)和相對(duì)含量看，醛類(lèi)和醇類(lèi)是整個(gè)烤制過(guò)程中表層和內(nèi)層的主要揮發(fā)性化合物。揮發(fā)性化合物總含量在烤制1.5 h時(shí)增加較多，說(shuō)明烤制1.5 h是烤羊腿揮發(fā)性化合物產(chǎn)生的關(guān)鍵點(diǎn)。

醛類(lèi)是脂肪降解的主要產(chǎn)物，其相對(duì)含量較高而感覺(jué)閾值低，對(duì)烤羊腿整體風(fēng)味貢獻(xiàn)值較大[18]。烤羊腿表層和內(nèi)層醛類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量隨著烤制時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，表層的醛類(lèi)物質(zhì)含量總體高于內(nèi)層。這是因?yàn)殡S著烤制時(shí)間的延長(zhǎng)氨基酸和肽的熱降解反應(yīng)增強(qiáng)，經(jīng)過(guò)脫氨、脫羧形成醛類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致醛類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量升高[19]。而氨基酸比起肽更穩(wěn)定，發(fā)生熱解程度小[20]。只有在烤肉或烤肉的表面局部脫水使溫度顯著高于水的沸點(diǎn)，才會(huì)發(fā)生氨基酸的裂解[21]。烤羊腿表層在烤制1.5 h時(shí)溫度高于水的沸點(diǎn)，而內(nèi)層溫度始終低于水的沸點(diǎn)，且烤制過(guò)程中的表層溫度始終高于內(nèi)層。所以表層的氨基酸和肽的熱降解反應(yīng)程度強(qiáng)于內(nèi)層。

表4 不同烤制時(shí)間烤羊腿表層揮發(fā)性化合物種類(lèi)及含量（n=3）Table 4 Types and contents of volatile compounds in the surface layer of roast lamb leg at different roasting time points (n= 3)

續(xù)表4

表5 不同烤制時(shí)間烤羊腿內(nèi)層揮發(fā)性化合物種類(lèi)及含量（n=3）Table 5 Types and contents of volatile flavor substances in inner layer of roast lamb leg at different roasting time points (n= 3)

續(xù)表5

烴類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)由于含量較低感覺(jué)閾值相對(duì)較高，對(duì)烤羊腿整體風(fēng)味貢獻(xiàn)值較小，但對(duì)于肉品整體風(fēng)味具有一定的修飾作用[22]。烴類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)自于脂肪酸烷氧自由基的均裂[23]，醇類(lèi)物質(zhì)來(lái)自于脂肪氧化[24]。酸類(lèi)物質(zhì)是脂肪氧化或脂肪水解過(guò)程中變?yōu)榈图?jí)脂肪酸產(chǎn)生的[25]。由于脂肪酸烷氧自由基的均裂和脂肪氧化程度會(huì)隨著溫度的升高而加強(qiáng)[26]，使烤羊腿表層和內(nèi)層的烴類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)含量隨烤制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。羊腿的表層脂肪主要為皮下脂肪，內(nèi)層為肌內(nèi)脂肪。在羊腿中皮下脂肪含量要高于肌內(nèi)脂肪，所以表層脂肪氧化和脂肪酸烷氧自由基的均裂程度高于內(nèi)層，由這些反應(yīng)生成的烴類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)的含量也高于內(nèi)層。

酯類(lèi)物質(zhì)主要是酸類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，其總含量的變化趨勢(shì)與酸類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)的總含量變化趨勢(shì)類(lèi)似[27]。其形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，糖酵解、蛋白質(zhì)水解、脂肪氧化及內(nèi)源酶作用都是酯類(lèi)化合物形成的主要途徑[28]。所以不同烤制時(shí)間烤羊腿表層和內(nèi)層的酯類(lèi)物質(zhì)隨著醇類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)含量的變化而變化?？狙蛲缺韺油?lèi)物質(zhì)含量高于內(nèi)層。這是由于酮類(lèi)物質(zhì)是脂肪氧化的另一類(lèi)主要產(chǎn)物[29]，這類(lèi)物質(zhì)可能是醇類(lèi)的氧化產(chǎn)物，也可能是酯類(lèi)分解的產(chǎn)物[30]。

雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)源于美拉德反應(yīng)、氨基酸及硫胺素的熱降解[31]。吡嗪類(lèi)化合物由α-氨基酮經(jīng)由美拉德反應(yīng)生成，美拉德反應(yīng)只有在110 ℃以上加熱時(shí)才會(huì)發(fā)生[32]。由于烤制過(guò)程中烤羊腿內(nèi)層溫度未超過(guò)110 ℃。所以烤羊腿只有表層發(fā)生了美拉德反應(yīng)。然而內(nèi)層也出現(xiàn)了含量極少的雜環(huán)類(lèi)類(lèi)化合物，這可能是由于隨著溫度升高時(shí)，羊腿內(nèi)層多孔介質(zhì)的孔隙和多孔介質(zhì)內(nèi)氣體的擴(kuò)散能力增大[33]。使表層的雜環(huán)類(lèi)化合物擴(kuò)散到了內(nèi)層。呋喃類(lèi)化合物大都具有很強(qiáng)的肉香味主要由硫胺素降解、焦糖糖化和碳水化合物降解產(chǎn)生[34]。由于羊腿烤制過(guò)程中表層的溫度始終高于內(nèi)層，使得表層氨基酸及硫胺素的熱降解程度高于內(nèi)層。所以表層的呋喃類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量高于內(nèi)層。

2.4 風(fēng)味組分ROAV結(jié)果

肉類(lèi)的揮發(fā)性化合物中，通常僅有一小部分對(duì)其總體香氣具有顯著貢獻(xiàn)，這部分對(duì)總體香氣起主導(dǎo)作用的稱為特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[35]。對(duì)新疆烤羊腿表層和內(nèi)層特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV進(jìn)行分析，探討不同烤制時(shí)間烤羊腿表層和內(nèi)層特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異。

圖1 烤羊腿表層（A）和內(nèi)層（B）特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV熱圖Fig. 1 Heat maps for ROAVs of characteristic volatile flavor compounds in surface layer (A) and inner layer (B) of roast lamb leg

如圖1所示，1-辛烯-3-醇、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、己醛對(duì)烤羊腿的香氣貢獻(xiàn)率較高。其中1-辛烯-3-醇、壬醛對(duì)烤羊腿表層的香氣貢獻(xiàn)高于烤羊腿的內(nèi)層、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、己醛對(duì)烤羊腿內(nèi)層香氣貢獻(xiàn)高于烤羊腿的表層。(E)-2-癸烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯醛、正己醇、正辛醇、正戊醇在烤制過(guò)程中的ROAV變化不大，對(duì)烤羊腿表層和內(nèi)層的香氣貢獻(xiàn)較小。特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)烤制2.5 h的烤羊腿表層和內(nèi)層的香氣貢獻(xiàn)最大。結(jié)合感官評(píng)價(jià)可知烤制時(shí)間為2 h的烤羊腿表層和內(nèi)層香氣最佳，最容易被接受。

3 結(jié) 論

本研究采用SPME-GC-MS分析不同烤制時(shí)間新疆烤羊腿表層和內(nèi)層的揮發(fā)性化合物的差異。研究表明羊腿表層和內(nèi)層分別檢測(cè)到揮發(fā)性化合物64 種和55 種，主要為烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)和苯酚類(lèi)。由于羊腿表層和內(nèi)層脂肪含量和烤制過(guò)程中的受熱程度的不同，使得烤羊腿表層的烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量高于內(nèi)層。1.5 h是烤羊腿中揮發(fā)性化合物產(chǎn)生的關(guān)鍵點(diǎn)。特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)烤制2.5 h時(shí)烤羊腿表層和內(nèi)層的香氣貢獻(xiàn)最大，1-辛烯-3-醇、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、己醛對(duì)烤羊腿的香氣貢獻(xiàn)較高。結(jié)合感官評(píng)價(jià)可知烤制2 h的烤羊腿表層和內(nèi)層香氣最佳，最容易被人們所接受。