抗耐藥性大腸桿菌乳酸菌的篩選及抑菌機(jī)制

孫 悅，劉佳伊，陳 璐，杜 宏，白鳳翎,*，呂欣然,*，張德福，郭曉華，勵(lì)建榮

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，大連工業(yè)大學(xué)和渤海大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 錦州 121013；2.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276800）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli），俗稱大腸桿菌，是雞肉及雞肉制品中的重要致病菌[1-3]，目前，由于我國(guó)雞禽業(yè)從傳統(tǒng)的散養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變?yōu)楦呙芏瑞B(yǎng)殖方式，增大了雞群體的發(fā)病率，同時(shí)也增加了抗生素在養(yǎng)殖過程中的使用量，但長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，引起雞禽局部或全身感染，嚴(yán)重時(shí)可造成全群覆滅，會(huì)給雞禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。此外，E. coli產(chǎn)生的耐藥性能通過食物鏈快速而廣泛的傳播，使人源、畜源致病性E. coli獲得相同的耐藥基因，使其產(chǎn)生相同的耐藥譜，耐藥性的傳播將衍生為全球公共衛(wèi)生焦點(diǎn)問題，對(duì)人類健康和流行病的防治構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。研究發(fā)現(xiàn)，E. coli易對(duì)阿奇霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素等藥物產(chǎn)生耐藥性[7]，因此亟需開發(fā)出一類安全高效且可以對(duì)抗多重耐藥菌的抗菌劑。生物抗菌劑具有安全高效、不易產(chǎn)生耐藥性和無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是控制食品中耐藥菌的優(yōu)良選擇[8]。

乳酸菌作為一種新型生物抗菌劑，目前已在肉制品、乳制品、果蔬、水產(chǎn)品等領(lǐng)域取得良好的應(yīng)用效果，其主要通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等代謝物質(zhì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[9-10]。Perales等[11]用乳酸菌細(xì)菌素AS-48和Nisin抑制從新鮮的山羊奶酪中提取出4 株耐藥性金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），其最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）均在0.16～0.43 μmol/L之間，當(dāng)二者協(xié)同處理指示菌時(shí)，MIC下降至0.04～0.05 μmol/L之間。楊柳[12]應(yīng)用中藥丹參提取物抑制耐環(huán)丙沙星的E. coli，MIC為253 μg/mL，當(dāng)其與環(huán)丙沙星聯(lián)用時(shí)，M I C 僅為原來的一半。蘭仕梅等[13]用連翹單獨(dú)作用于多重耐藥E. coli時(shí)，MIC為125 mg/mL，當(dāng)連翹與四環(huán)素聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)耐藥性E. coli的MIC為62.5 mg/mL。目前，關(guān)于從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出抗耐藥性E. coli的乳酸菌及其拮抗作用機(jī)制研究比較鮮見[14]。

本研究以從河北石家莊養(yǎng)雞場(chǎng)雞糞中分離出的對(duì)阿奇霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、喹諾酮類耐藥的E. coli為目標(biāo)菌，采用牛津杯打孔法從遼寧葫蘆島酸菜湯分離篩選對(duì)耐藥性E. coli拮抗活性較強(qiáng)的乳酸菌。通過測(cè)定乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli電導(dǎo)率、胞外蛋白、紫外吸收物質(zhì)含量，初步探究乳酸菌粗提物對(duì)耐藥菌的作用機(jī)制。以期為利用生物抗菌劑控制耐藥菌提供一定的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

酸菜購(gòu)于遼寧葫蘆島市場(chǎng)；耐藥性E. coli0001為河北石家莊養(yǎng)雞場(chǎng)雞糞中分離，保藏于本院微生物學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、亞胺培南、磷霉素、慶大霉素、多黏菌素、頭孢他啶10 種抗生素（質(zhì)量濃度均為15 μg/mL）上海廣銳生物科技有限公司；瓊脂糖 美國(guó)Sigma公司；TaqPCR Master mix、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA Marker-D 生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管 杭州天合微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；S-4800掃描電鏡 日本日立公司；賽福智能生化培養(yǎng)箱寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；PHSJ-3F pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FA1004精密電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器 德國(guó)IKA公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

參照文獻(xiàn)[15]。無菌條件下取適量酸菜湯樣品，采用無菌接種環(huán)挑取樣品汁液1 環(huán)，劃線于含1.0% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，選取有溶鈣圈的乳白色典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色。

1.3.2 乳酸菌粗提物的制備

將-80 ℃保存的乳酸菌菌株以2%的接種量在MRS液體培養(yǎng)基中活化3 代，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，用0.45 μm濾菌器過濾上清液，得無細(xì)胞上清液。將乳酸菌上清液和乙酸乙酯按5∶1的比例加入至分液漏斗中，充分振蕩混勻，靜置5 min出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象，取上層乳化液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，該萃取步驟重復(fù)5 次，并將得到的乳化液統(tǒng)一收集，真空條件下55 ℃、100 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體顏色澄清，統(tǒng)一保存。在真空度0.420、-40 ℃條件下真空冷凍干燥48 h至粉末顆粒狀，后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 供試菌菌懸液的制備

將河北石家莊養(yǎng)雞場(chǎng)雞糞中分離的耐藥性E. coli 0001以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，傳3 代，30 ℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水稀釋濃度至1.0×106CFU/mL。

1.3.4 乳酸菌菌株鑒定

1.3.4.1 生理生化反應(yīng)

參照文獻(xiàn)[16-17]對(duì)乳酸菌菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.4.2 菌株的16S rDNA鑒定

參 照 文 獻(xiàn)[ 1 8 ] 。 P C R 擴(kuò) 增 引 物 ： 2 7 f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）。PCR應(yīng)用25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系：上下游引物各1.0 μL，2.0 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，用超純水補(bǔ)足到25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。

1.3.5 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli抑菌機(jī)理分析

1.3.5.1 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli的MIC

參照Rapper等[19]的方法。將凍干后的菌株XCT1-1粗提物分別加至10 mL LB液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度分別為24、12、6、3、1.5、0.75 mg/mL。再分別加入200 μL 1.0×106CFU/mL E. coli菌懸液，30 ℃培養(yǎng)24 h，通過肉眼觀察到無渾濁現(xiàn)象對(duì)應(yīng)的濃度即為乳酸菌的MIC。

1.3.5.2 不同抗菌藥物與乳酸菌粗提物復(fù)合對(duì)耐藥性E. coli拮抗作用

參照王唯霖[20]的方法。采用牛津杯打孔法，每個(gè)孔均加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC），再相應(yīng)加入阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、亞胺培南、磷霉素、慶大霉素、多黏菌素、頭孢他啶10 種具有代表性的藥敏紙片，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.5.3 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性 E. coli電導(dǎo)率的影響

參照范宇[21]的方法。分別在10 mL E. coli菌懸液中加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）、阿奇霉素、菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）+阿奇霉素，同時(shí)以未經(jīng)處理的E. coli菌懸液為對(duì)照組。30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取樣，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分別取其上清液測(cè)定電導(dǎo)率。

1.3.5.4 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性 E. coli胞外蛋白的影響

參考Bradford[22]的方法，分別取1 mL 1.3.5.3節(jié)方法所得的上清液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，室溫下反應(yīng)2 min，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，并按下式計(jì)算胞外蛋白含量：

1.3.5.5 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性 E. coli紫外吸收物質(zhì)的影響

按LV Feng等[23]的方法。分別取1 mL 1.3.5.3節(jié)方法所得的上清液，260 nm波長(zhǎng)處的吸光度即為核酸泄漏含量。

1.3.5.6 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性 E. coli細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

參照Bueno等[24]的方法。分別在 E. coli菌懸液中加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）、阿奇霉素、菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）+阿奇霉素，同時(shí)以 E. coli菌懸液為對(duì)照組。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體。在2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，除去殘留戊二醛，分別用50%、80%、100%乙醇進(jìn)行脫水處理，用膠頭滴管取適量滴于潔凈蓋玻片，自然晾干，噴金鏡檢。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗耐藥性 E. coli乳酸菌的分離和初篩

從酸菜湯中共分離得到51 株具有白色溶鈣圈的典型菌落，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)確定39 株為乳酸菌。采用牛津杯打孔法從39 株乳酸菌中篩選出6 株對(duì)耐藥性E. coli具有拮抗活性的乳酸菌，分別為菌株XCT1-1、XCT1-2、XCT1-3、XCT1-4、XCT1-5、XCT1-6，其對(duì)耐藥性E. coli的抑菌直徑分別為20.31、15.42、15.69、11.18、14.96 mm。其中，菌株XCT1-1對(duì)耐藥性E. coli抑菌直徑最大（圖1），因此，選擇菌株XCT1-1進(jìn)行下一步研究。

圖1 乳酸菌對(duì)耐藥性E. coli拮抗作用Fig. 1 Antagonistic effect of lactic acid bacteria on drug-resistant E. coli

2.2 乳酸菌菌株鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

菌株XCT1-1生理生化鑒定結(jié)果見表1，依據(jù)文獻(xiàn)[16-17]檢索可初步判斷菌株XCT1-1為乳桿菌屬。

表1 菌株XCT1-1生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain XCT1-1

2.2.2 16S rDNA鑒定

圖2 菌株XCT1-1的16S rDNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig. 2 PCR amplification of 16S rDNA gene of strain XCT1-1

由圖2可知，菌株XCT1-1在1 450 bp處左右出現(xiàn)特異性條帶，表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。菌株XCT1-1和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）EU600907.1聚于一支，親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)97%。因此，鑒定菌株XCT1-1被鑒定為植物乳桿菌。

圖3 菌株XCT1-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain XCT1-1

2.3 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli抑菌機(jī)理分析

2.3.1 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli的MIC

耐藥性E. coli經(jīng)不同質(zhì)量濃度植物乳桿菌XCT1-1粗提物處理12 h后，肉眼觀察到6.0 mg/mL及以上質(zhì)量濃度無渾濁現(xiàn)象，即植物乳桿菌XCT1-1 MIC為6.0 mg/mL。Yi Lanhua等[25]研究發(fā)現(xiàn)，從江水中分離出的棒狀乳桿菌（L. coryniformis）XN8產(chǎn)生的細(xì)菌素lactocin XN8-A對(duì)E. coli和S. aureus的MIC均為6.85 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相似。

2.3.2 不同抗菌藥物與乳酸菌粗提物復(fù)合對(duì)耐藥性E. coli的拮抗作用

圖4 不同抗菌藥物和植物乳桿菌粗提物復(fù)合對(duì)耐藥性E. coli的拮抗作用結(jié)果Fig. 4 Antagonistic effects of different antibacterial drugs and L. plantarum on drug-resistant E. coli

由圖4可知，阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素5 種藥物對(duì)E. coli均無抑制作用。但加入植物乳桿菌XCT1-1粗提物后，抑菌圈直徑分別達(dá)到27.56、27.31、28.91、27.89、28.90 mm，同時(shí)也均大于單獨(dú)添加植物乳桿菌XCT1-1粗提物的抑菌圈直徑（P＜0.05）。結(jié)果表明，植物乳桿菌XCT1-1粗提物對(duì)耐藥性E. coli有拮抗活性，同時(shí)還能提高了耐藥性E. coli對(duì)藥物的敏感性。選擇E. coli耐受的其中一種藥物阿奇霉素進(jìn)行下一步的研究。

2.3.3 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性 E. coli電導(dǎo)率的影響

圖5 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對(duì)耐藥性E. coli電導(dǎo)率的影響Fig. 5 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on the electrical conductivity of drug-resistant E. coli

細(xì)菌菌懸液的電導(dǎo)率變化是細(xì)胞膜滲透性變化的間接表現(xiàn)形式[26]。由圖5可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，耐藥性E. coli電導(dǎo)率整體呈上升趨勢(shì)。經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的耐藥性E. coli菌懸液電導(dǎo)率值明顯高于未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液（P＜0.05）。在處理末期第10小時(shí)，乳酸菌粗提物最大程度提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性，且經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液相比電導(dǎo)率值分別增加了20.54%、21.93%（P＜0.05）；經(jīng)阿奇霉素處理的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液相比電導(dǎo)率值無顯著性差異。結(jié)果表明：植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以改變耐藥性E. coli細(xì)胞膜的通透性，共同作用效果強(qiáng)可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性。侯媛媛[27]在處理末期第8小時(shí)，用大黃酸處理耐藥性E. coli和腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica）的實(shí)驗(yàn)組比未經(jīng)處理組電導(dǎo)率值分別高約67.50%、66.67%，與本研究結(jié)果相似。

2.3.4 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli胞外蛋白的影響

圖6 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對(duì)耐藥性E. coli胞外蛋白含量的影響Fig. 6 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on the extracellular protein content of drug-resistant E. coli

蛋白質(zhì)泄漏是評(píng)定細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的一個(gè)重要指標(biāo)[28]。由圖6可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，耐藥性E. coli胞外蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的耐藥性E. coli菌懸液的胞外蛋白含量明顯高于未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液（P＜0.05）。在處理末期第10小時(shí)，乳酸菌粗提物最大程度提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性，且經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，胞外蛋白含量分別增加了25.24%、27.93%（P＜0.05）；經(jīng)阿奇霉素處理的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，胞外蛋白含量無顯著性差異。結(jié)果表明：植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以破壞耐藥性E. coli細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，共同作用效果強(qiáng)可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性。王維霖[20]在處理末期第8小時(shí)，用五倍子提取物處理耐藥性E. coli的實(shí)驗(yàn)組比未經(jīng)處理組胞外蛋白含量高約75%，與本研究結(jié)果相似。

2.3.5 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli紫外吸收物質(zhì)的影響

圖7 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對(duì)耐藥性E. coli紫外吸收物質(zhì)的影響Fig. 7 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on UV absorbing compounds of drug-resistant E. coli

核酸的OD260nm值用作評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)[29]。由圖7可知，經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的耐藥性E. coli菌懸液核酸泄漏值顯著高于未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液（P＜0.05）。在處理末期第10小時(shí)，乳酸菌粗提物最大程度地提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性，且經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，核酸泄漏值分別增加了63.56%、77.12%（P＜0.05）；經(jīng)阿奇霉素處理的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，核酸泄漏值無顯著性差異。結(jié)果表明：植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以破壞耐藥性E. coli細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，共同作用效果強(qiáng)可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性。Alavi等[30]采用松蘿酸處理耐藥性E. coli的實(shí)驗(yàn)組比未經(jīng)處理組紫外吸收物質(zhì)含量高約70.59%，與本研究結(jié)果相似。

2.3.6 乳酸菌粗提物對(duì)耐藥性E. coli細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

圖8 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對(duì)耐藥性E. coli作用的掃描電鏡結(jié)果Fig. 8 SEM photographs showing of the effect of the cultute supernantant extract of L. plantarum XCT1-1 on the cell structure of drug-resistant E. coli

由圖8a可知，未經(jīng)處理的耐藥性E. coli菌體細(xì)胞表面圓潤(rùn)光滑，結(jié)構(gòu)完整；由圖8b可知，經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物處理后的耐藥性E. coli菌體細(xì)胞邊緣出現(xiàn)褶皺并有溶解跡象；由圖8c可知，經(jīng)植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用處理后的耐藥性E. coli細(xì)胞完整性完全喪失，細(xì)胞溶解程度進(jìn)一步增加，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)坍塌。Al-Wrafy等[31]用噬菌體蛋白PAPP使耐藥性銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）細(xì)胞膜被破壞，有溶解跡象，噬菌體蛋白PAPP與哌拉西林疊加處理，耐藥性P. aeruginosa細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，細(xì)胞基本溶解。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié) 論

本研究從遼寧葫蘆島酸菜湯中篩選出1 株對(duì)耐藥性E. coli具有較強(qiáng)拮抗活性的植物乳桿菌XCT1-1，抑菌直徑達(dá)20.31 mm。經(jīng)菌株XCT1-1粗提物、菌株XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用耐藥性E. coli后，導(dǎo)致其胞外電導(dǎo)率增加，胞內(nèi)蛋白合成受到影響，胞內(nèi)核酸發(fā)生泄漏。掃描電鏡結(jié)果進(jìn)一步表明，菌株XCT1-1粗提物、菌株XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同處理耐藥性E. coli后，可破壞E. coli的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，前者菌體表面出現(xiàn)褶皺，后者菌體表面褶皺嚴(yán)重，菌體細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)坍塌。以上結(jié)果表明，植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用都是通過膜損傷發(fā)揮拮抗作用，并推斷共同作用效果強(qiáng)可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對(duì)耐藥性E. coli的敏感性，且乳酸菌和阿奇霉素可發(fā)生協(xié)同拮抗效應(yīng)。研究為控制食品中耐藥性E. coli和研究抗耐藥菌生物制劑提供一定的理論基礎(chǔ)。