濃香型白酒酒醅中總RNA 提取方法評(píng)價(jià)

胡曉龍，王康麗，宋麗麗，侯建光，曹振華，吳麗麗，牛廣杰，馬歌麗，趙書(shū)民，趙 東

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后研發(fā)基地，河南 澠池 472000；3.河南宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477200；4.河南省壽酒有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000；5.河南省酒業(yè)協(xié)會(huì)，河南 鄭州 450000；6.五糧液集團(tuán)有限公司，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒作為我國(guó)優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表，風(fēng)格獨(dú)特，深受消費(fèi)者青睞，其產(chǎn)銷量均占中國(guó)白酒行業(yè)的主導(dǎo)地位[1]。在釀造過(guò)程中，酒醅是微生物發(fā)酵的主要載體和白酒呈香物質(zhì)的直接來(lái)源，因此，研究酒醅活性微生物菌群的多樣性、代謝特征及相互作用等是闡明濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵機(jī)制及風(fēng)味物質(zhì)溯源的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

近年來(lái)，在RNA水平上進(jìn)行的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)被不斷運(yùn)用于微生物群落研究，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是后基因組時(shí)代最具代表性的新技術(shù)[2]，通過(guò)對(duì)特定時(shí)期、特定環(huán)境樣品中所有微生物群落的RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，可以直接獲得環(huán)境中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)錄組信息，能真實(shí)地反映出活性微生物狀態(tài)及其動(dòng)態(tài)變化[3]。例如，Urich等[4]通過(guò)對(duì)沙質(zhì)土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物RNA轉(zhuǎn)錄本的分析得到了許多未被人們發(fā)現(xiàn)的基因組序列，且發(fā)現(xiàn)有5 種不同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類發(fā)生了變化，并得到了這些細(xì)菌的代謝機(jī)制變化以作為預(yù)測(cè)生物體活動(dòng)的指標(biāo)。Franzosa等[5]在關(guān)聯(lián)人體腸道的宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)有部分微生物可在DNA水平上檢測(cè)到但很少具有轉(zhuǎn)錄活性，且RNA水平功能組成的組間差異明顯強(qiáng)于DNA水平，因此僅鑒定DNA水平上微生物的單獨(dú)貢獻(xiàn)（高或低）并不能完全反映它們?cè)谌郝渲械淖饔谩Ｒ訰NA為基礎(chǔ)的宏轉(zhuǎn)錄組等分子生物學(xué)研究則能幫助更好地了解濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中活性微生物群落的特征及變化，而提取的總RNA質(zhì)量好壞對(duì)后續(xù)的研究結(jié)果影響較大。

能否有效去除各種雜質(zhì)和RNA酶是成功提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵，目前常見(jiàn)的環(huán)境樣品RNA提取方法有Trizol法、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法、異硫氰酸胍法、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法和已商品化的試劑盒法。異硫氰酸胍是強(qiáng)烈的蛋白變性劑，可有效抑制RNA酶的活性[6]，此方法可得到較高產(chǎn)量的總RNA，但耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于大量樣品的提取[7]。Trizol是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取出高總產(chǎn)量的總RNA[8-10]，但需液氮研磨，實(shí)驗(yàn)條件苛刻、成本較高，提取富含多糖和多酚的樣品總RNA時(shí)會(huì)存在嚴(yán)重的污染。CTAB法操作需要預(yù)熱，溫度過(guò)高會(huì)使得RNA酶變得活躍導(dǎo)致RNA降解，同時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng)、操作繁瑣[11]。試劑盒法提取RNA雖然方便快捷，可得到高純度的RNA，但產(chǎn)量較低、費(fèi)用高，且對(duì)不同的樣品具有選擇性[12]。SDS法雖然試劑簡(jiǎn)單易配制，但其無(wú)法抑制內(nèi)源性RNA酶的活性，在提取過(guò)程中RNA降解嚴(yán)重，將其與苯酚結(jié)合可在抑制RNA酶的同時(shí)使蛋白質(zhì)等變性，再結(jié)合玻璃珠物理破碎法，可有效地裂解土壤等環(huán)境樣品，用以大量提取總RNA[13-15]。

酒醅中多糖、酚類、鹽類、腐殖質(zhì)、腐殖酸和代謝色素等雜質(zhì)大量存在，形成了酒醅復(fù)雜的環(huán)境結(jié)構(gòu)[16]，所以其總RNA的提取存在一定困難。另外，不同提取方法獲得的微生物群落多樣性及其種類、豐度均不同[17]。目前酒醅總RNA提取可采用Trizol法、月桂酸鈉法[11,18]，然而，有關(guān)酒醅總RNA提取方法的比較研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究建立了一種改良的SDS-苯酚法，并從提取成本及耗時(shí)、RNA質(zhì)量濃度和純度、電泳結(jié)果、反轉(zhuǎn)錄效果及高通量測(cè)序分析5 個(gè)方面比較其與目前常規(guī)的4 種RNA提取方法提取濃香型白酒酒醅總RNA的效果，包括試劑盒法、Trizol法、CTAB法和月桂酸鈉法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品取自河南省某知名濃香型白酒企業(yè)，發(fā)酵時(shí)間為7 d和15 d的酒醅樣品各200 g，放入無(wú)菌厭氧袋中并作好標(biāo)記，迅速放于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃保藏。窖泥護(hù)理液（主要為Clostridia綱細(xì)菌）來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。

SDS 上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；月桂酸鈉、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、異戊醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、CTAB、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海麥克林生化科技有限公司；Trizol、水飽和酚 上海源葉生物科技有限公司；異丙醇、無(wú)水乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；Tris、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、RNase-Free Water、2×Taq Master Mix 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；E.Z.N.A.TMSoil RNA Kit 美國(guó)Omega公司；Recombinant DNase I、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 大連TaKaRa公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MP200A精密電子天平 上海良豐儀器儀表有限公司；C1000溫度梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；TGL-20M高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；Mixer4K微型渦旋混合儀 生工生物工程（上海）股份有限公司；KW-1000DC恒溫水浴鍋、85-2恒溫磁力攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠；IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī)常熟市雪科電器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；WD-9403C紫外儀 北京六一生物科技有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計(jì)賽默飛世爾科技公司；Illumina MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

提取RNA所用的槍頭、離心管、燒杯、玻璃棒等均需用0.1% DEPC溶液浸泡過(guò)夜，之后1×105Pa滅菌30 min，烘干備用；電泳槽和制膠用具用3%的H2O2溶液浸泡30 min，再用DEPC溶液沖洗干凈。

1.3 方法

1.3.1 酒醅總RNA的提取方法

1.3.1.1 酒醅預(yù)培養(yǎng)

將低溫保存發(fā)酵7 d和15 d的酒醅樣品各取出100 g，分別置于無(wú)菌厭氧培養(yǎng)袋中，每個(gè)樣品均按5%接種量分別添加窖泥護(hù)理液，將接種后的培養(yǎng)袋置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)3 d，以期獲取更多有活性的微生物。

1.3.1.2 SDS-苯酚法

參照趙俊等[19]總RNA提取方法進(jìn)行改良。1）取7 g酒醅于50 mL離心管中，加入5 mL 1 mol/L的CaCl2溶液和5 mL 5% PVP溶液，渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入10 mL 0.05 mol/L的草酸鈉溶液，用相同的方法離心、棄上清液。2）加入3 顆玻璃珠（d=0.5 cm）和12 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，渦旋振蕩5 min后500 r/min離心5 min，取上清液至新的離心管中，沉淀重復(fù)洗滌一次，2 次上清液混合后離心3 min，棄去上清液收集細(xì)胞沉淀。3）在得到的細(xì)胞沉淀中加入玻璃珠（0.5 mm：0.33 g，0.1 mm：0.17 g）和300 μL SDS提取液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTANa2，10 mmol/L MgCl2，1% SDS，6%水飽和酚，0.1% β-巰基乙醇），最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩5 min，然后15 000 r/min、4 ℃離心2 min，取上清液至新的離心管中，再重復(fù)一次；4）向合并的上清液中加入500 μL水飽和酚（pH 4.5），渦旋混勻后離心2 min，取上清液；再加入500 μL的氯仿-異戊醇（24∶1），用相同的方法混勻、離心、回收上清液。5）上清液加入2 倍體積的PEG-NaCl（30% PEG，1.6 mol/L NaCl）溶液，低溫靜置2 h后15 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液。6）用200 μL 70%乙醇溶液清洗沉淀，最后加入50 μL RNase-free water溶解RNA。

1.3.1.3 試劑盒法

稱取7 g酒醅樣品于50 mL離心管中，用15 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，加入3 顆玻璃珠（d=0.5 cm），渦旋振蕩5 min，然后500 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌3 次，離心后收集上清液。全部上清液于9 000 r/min離心3 min，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。對(duì)預(yù)處理后的酒醅樣品按照E.Z.N.A.TMSoil RNA Kit（Omega）的試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行總RNA提取。

1.3.1.4 Trizol法

本方法與SDS-苯酚法基本相同，不同的是采用Trizol試劑抽提，將步驟3）中的SDS提取液換成Trizol試劑。

1.3.1.5 CTAB法

參照Griffiths等[20]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。首先進(jìn)行預(yù)處理（方法同試劑盒法），然后在預(yù)處理后的酒醅樣品中加入0.5 mL CTAB提取液（等體積的磷酸鉀緩沖液與10% CTAB溶液配制）和玻璃珠（0.5 mm：0.33 g，0.1 mm：0.17 g），在FastPrep勻漿儀上以6 m/s的速率破碎45 s；16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液；加入0.5 mL苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），渦旋混勻，16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液；上清液加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），渦旋混勻，16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液；上清液加入2 倍體積PEG-NaCl（30% PEG，1.6 mol/L NaCl），上下顛倒混勻，低溫靜置2 h，18 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清液；加入200 μL 70%乙醇溶液清洗沉淀，16 000×g離心5 min，棄掉液體，并吹干沉淀，加入50 μL RNase-free water溶解RNA，然后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.1.6 月桂酸鈉法

本方法與SDS-苯酚法基本相同，不同的是采用月桂酸鈉抽提液提取，將步驟3）中的SDS提取液換成月桂酸鈉抽提液（25 份月桂酸鈉緩沖液（0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.02 mol/L pH 8.0 EDTANa2，月桂酸鈉10 g/L），15 份Trizol，1.5 份β-巰基乙醇，0.5 份二硫蘇糖醇）[11]。

1.3.2 酒醅總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

1.3.2.1 濃度及純度測(cè)定

分別吸取利用上述5 種方法所獲得的總RNA樣品各2 μL，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)RNA樣品用于表征濃度的260 nm波長(zhǎng)處OD值，以及表征樣品純度的OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm比值。

1.3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳

取20 mL 1×TAE溶液，加入0.2 g的瓊脂糖粉，加熱至沸騰，室溫冷卻至 50～60 ℃后，加入2 μL Goldview I型核酸染料，倒入制膠槽中冷卻至凝固。每個(gè)RNA樣品取5 μL分別與1 μL的6×DNA loading buffer均勻混合，然后將其與Marker分別點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠，于100 V電泳30 min。

1.3.2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）驗(yàn)證

利用Recombinant DNase I除去上述RNA樣品中的DNA，以防止DNA污染導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)偏差。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

參照Z(yǔ)hang Yuguang等[21]描述的方法，使用細(xì)菌通用引物515F和806R、相應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件對(duì)上述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2.4 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

針對(duì)酒醅反轉(zhuǎn)錄cDNA模板，采用微生物16S rRNA基因的通用引物擴(kuò)增V3和V4兩個(gè)高度可變區(qū)。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s；72 ℃終延伸5 min；共進(jìn)行24 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切割回收目標(biāo)產(chǎn)物片段進(jìn)行純化，再進(jìn)一步通過(guò)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物純化效果。然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)文庫(kù)濃度，將文庫(kù)定量到10 nmol/L，按Illumina MiSeq儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PE250/PE300雙端測(cè)序，由MiSeq自帶的MiSeq Control Software讀取序列信息。

對(duì)雙端測(cè)序得到的正反向reads首先進(jìn)行兩兩拼接，過(guò)濾拼接結(jié)果中含有N的序列，保留序列長(zhǎng)度大于200 bp的序列。經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列使用VSEARCH（1.9.6）進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類（序列相似性設(shè)為97%），比對(duì)的16S rRNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva 132。然后利用RDP classifier（Ribosomal Database Program）貝葉斯算法對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成?；贠TU得到分析結(jié)果，采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽平的方法，分別計(jì)算Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)等α多樣性指數(shù)反映群落的物種豐度和多樣性，再通過(guò)層次聚類中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）聚類樹(shù)，并基于樣本OTU豐度進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量濃度及純度、成本及耗時(shí)分析

如表1所示，5 種方法均能提取到酒醅樣品中總RNA，其中試劑盒法提取的總RNA平均質(zhì)量濃度最高（1 190.8 ng/μL），分別為SDS-苯酚法（647.6 ng/μL）、Trizol法（512 ng/μL）、CTAB法（385.65 ng/μL）和月桂酸鈉法（62.2 ng/μL）的1.84、2.33、19.14 倍和3.09 倍。5 種方法所得總RNA樣品的OD260nm/OD230nm存在較大差異，其中SDS-苯酚法和試劑盒法提取的酒醅總RNA的OD260nm/OD230nm均大于2.0，表明這兩種方法所提取出的酒醅總RNA中多糖、酚類、腐殖酸和有機(jī)溶劑等物質(zhì)的污染較小，純度高[22]。而Trizol法、CTAB法和月桂酸鈉法提取的酒醅總RNA樣品的OD260nm/OD230nm遠(yuǎn)小于2.0，其平均值分別為0.29、1.10和0.58，表明這3 種方法所提取的RNA樣品中存在多糖、酚類、腐殖酸或有機(jī)溶劑等物質(zhì)的污染現(xiàn)象，純度較差，尤其是CTAB法所提RNA樣品純度最差，進(jìn)而會(huì)對(duì)后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)（如real-time PCR、RT-PCR及電泳分析等）產(chǎn)生不同程度的干擾。SDS-苯酚法和Trizol法所提取酒醅總RNA的OD260nm/OD280nm均在1.8～2.0之間，表明這兩種方法所提取的RNA樣品中蛋白質(zhì)污染較小，純度較好。試劑盒法所提取的酒醅總RNA的OD260nm/OD280nm大于2.0，表明該方法所提取的總RNA有降解發(fā)生[23]。CTAB法和月桂酸鈉法提取的酒醅總RNA樣品的OD260nm/OD280nm均較低，表明RNA樣品中存在蛋白質(zhì)等物質(zhì)的污染，純度較差。

從提取每個(gè)酒醅樣品總RNA所需要試劑的費(fèi)用進(jìn)行比較，SDS-苯酚法和CTAB法成本最低，試劑盒法成本最高，提取一次RNA的費(fèi)用約49 元。5 種方法提取RNA耗時(shí)在3.5～5 h之間，試劑盒法耗時(shí)最短，其余方法在5 h左右。

2.2 總RNA完整性分析

圖1 5 種方法提取酒醅總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from fermented grains extracted by five extraction methods

如圖1所示，采用同種方法提取兩種酒醅所得RNA的電泳條帶無(wú)明顯差異，但不同方法所提RNA亮度差異較大，試劑盒法和SDS-苯酚法所提取的RNA條帶亮度明顯亮于Trizol法，CTAB法未檢測(cè)到條帶，這也與RNA質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果一致。SDS-苯酚法提取酒醅總RNA中23S和16S條帶清晰整齊，5S條帶不明顯，其中23S條帶亮度與16S基本一致，說(shuō)明RNA完整性較好。試劑盒法提取酒醅總RNA 23S和16S條帶模糊不整齊，電泳條帶彌散，整體提取效果一般。Trizol法提取酒醅總RNA 23S和16S條帶不夠清晰完整，5S條帶明顯，略有拖帶，表明RNA部分降解、有雜質(zhì)污染，提取效果一般。月桂酸鈉法提取酒醅總RNA僅有5S條帶清晰可見(jiàn)且不規(guī)整，表明RNA降解嚴(yán)重，完整性差。

2.3 RT-PCR檢測(cè)分析

圖2 5 種方法提取酒醅總RNA進(jìn)行RT-PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplified total RNA extracted from fermented grains with five extraction methods

采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析上述方法所得總RNA的完整性及用于后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性，結(jié)果如圖2所示。除CTAB法、月桂酸鈉法外，SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法代表的6 個(gè)泳道均出現(xiàn)了目的條帶，表明這3 種方法所提RNA均能有效地進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，條帶大小在290 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致；結(jié)合RNA純度的分析結(jié)果（表1），3 種方法所提取的總RNA基本無(wú)蛋白質(zhì)污染，同時(shí)總RNA質(zhì)量濃度高，對(duì)后續(xù)RT-PCR影響不大。但Trizol法提取總RNA的OD260nm/OD230nm偏低，考慮會(huì)對(duì)后續(xù)分析結(jié)果有影響，將進(jìn)一步結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2.4 高通量數(shù)據(jù)分析

表2 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對(duì)酒醅活性群落種屬鑒定結(jié)果的影響Table 2 Effect of RNA extraction methods on the identification of microbial communities in fermented grains

根據(jù)RT-PCR結(jié)果，本研究選取了SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣本用于高通量測(cè)序16S rRNA，結(jié)果表明，3 種方法提取的RNA對(duì)結(jié)果的影響存在差異。如圖3A所示，SDS-苯酚和試劑盒法結(jié)果相似，即發(fā)酵7 d酒醅OTU數(shù)量均高于15 d的酒醅，與Trizol法所得結(jié)果相反，說(shuō)明高通量測(cè)序結(jié)果與樣品和RNA的提取方法均有關(guān)系[19]。采用上述3 種方法從酒醅中共檢測(cè)到2 個(gè)門、3 個(gè)綱、4 個(gè)目、6 個(gè)科和7 個(gè)屬，每種方法所對(duì)應(yīng)每個(gè)分類水平的數(shù)量見(jiàn)表2。不同方法對(duì)酒醅樣品中細(xì)菌不同分類水平種屬鑒定數(shù)量（圖3B）及細(xì)菌群落Chao1指數(shù)（圖3C）沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明上述指標(biāo)主要是由樣品決定的。由圖3D可知，微生物群落多樣性的趨勢(shì)為SDS-苯酚法＞Trizol法＞試劑盒法，其中SDS-苯酚法所得Shannon指數(shù)顯著高于試劑盒法（P＜0.05），說(shuō)明結(jié)合高通量測(cè)序分析，SDS-苯酚法所提取的RNA能更好地反映酒醅群落的群落的多樣性。

圖3 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對(duì)酒醅活性群落α多樣性分析影響Fig. 3 Effect of RNA extraction methods on α-diversity analysis of microbial communities in fermented grains

圖4 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對(duì)酒醅活性群落綱水平組成影響Fig. 4 Effects of RNA extraction methods on microbial community composition at class level in fermented grains

在原核微生物綱水平（圖4A），SDS-苯酚法和試劑盒法在2 種酒醅中提取的綱數(shù)量均一致，分別是芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia），而Trizol法除了提取到芽孢桿菌綱和梭菌綱外，在15 d酒醅中還提取到γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），但其相對(duì)豐度僅為0.01%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)（圖4B），SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法均表現(xiàn)出芽孢桿菌綱的相對(duì)豐度升高，漲幅分別為0.11%、0.05%、0.15%，相反，梭菌綱的相對(duì)豐度降低，降幅分別為0.2%、0.05%、0.16%，這可能與酒醅的特性有關(guān)，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，芽孢桿菌綱的乳桿菌屬作為酒醅微生物群中的優(yōu)勢(shì)菌不斷增加。結(jié)果表明，不同方法提取的綱數(shù)量和相對(duì)豐度存在一定差異，但基本變化趨勢(shì)一致。

在原核微生物屬水平（圖5A），兩種酒醅共計(jì)檢測(cè)到7 個(gè)屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_10）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、短小芽孢桿菌（Brevibacillus）、水棲菌屬（Enhydrobacter）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），3 種方法提取微生物的數(shù)量和相對(duì)豐度均有一定差異。在7 d酒醅中，SDS-苯酚法和試劑盒法均提取到了5 個(gè)屬（圖5B、C），Trizol法提取到了4 個(gè)屬（圖5D）；在15 d酒醅中，SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法分別提取到了4、6、5 個(gè)屬，其中試劑盒法偏好性地提取到了類芽孢桿菌屬，Trizol法偏好性地提取到了水棲菌屬，但兩者相對(duì)豐度均僅為0.01%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)（圖5B～D），3 種方法所得原核微生物中相對(duì)豐度排名前3的乳桿菌屬、梭菌屬和芽孢桿菌屬的變化趨勢(shì)均一致，乳桿菌屬不斷增加，梭菌屬和芽孢桿菌屬則不斷下降，這些結(jié)果與綱水平上的結(jié)果一致。盡管3 種方法所得微生物豐度并不完全相同，但3 種方法均能反映出兩種酒醅原核微生物群之間的差異，并且規(guī)律基本一致。

圖5 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對(duì)酒醅活性群落屬水平組成影響Fig. 5 Effects of RNA extraction methods on microbial community composition at genus level in fermented grains

根據(jù)UPGMA聚類樹(shù)分析和PCA結(jié)果（圖6），Trizol法在反映樣本間差異方面的效果最好，SDS-苯酚法次之，試劑盒法則較差。雖然試劑盒法和Trizol法偏好性地提取到了1 個(gè)屬，但其相對(duì)豐度過(guò)低，不能完全反映其在發(fā)酵過(guò)程中的變化情況。所以，決定原核微生物群的因素不僅有酒醅類型，提取方法在反映其豐度變化及樣本差異方面的影響可能更大。

圖6 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對(duì)酒醅活性群落β多樣性影響Fig. 6 Effect of RNA extraction methods on β-diversity analysis of active microbial populations in fermented grains

3 討 論

酒醅作為白酒釀造過(guò)程中微生物發(fā)酵的主要載體和白酒呈香物質(zhì)的直接來(lái)源，影響其RNA提取質(zhì)量的因素有多種，一般分為外因和內(nèi)因：內(nèi)因主要指酒醅環(huán)境中多糖、蛋白質(zhì)、酚類及腐殖質(zhì)等雜質(zhì)含量較高，多糖類的溶解性質(zhì)與RNA相似不容易被去除[24]，而蛋白質(zhì)則影響RT-PCR，酚與RNA結(jié)合會(huì)影響RNA活性[25]；外因通常也影響RNA提取的質(zhì)量，如實(shí)驗(yàn)人員的不規(guī)范操作、實(shí)驗(yàn)儀器以及試劑的污染等。因此，克服內(nèi)因和外因?qū)NA的不良影響，是得到高質(zhì)量RNA成敗的關(guān)鍵。對(duì)酒醅樣品進(jìn)行預(yù)處理，則是一種簡(jiǎn)單有效的方法，能有效地去除大量雜質(zhì)，保證后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行[16]。

CTAB法在應(yīng)用于酒醅提取時(shí)，濃度及純度都很低，可能是由于裂解液不能完全裂解細(xì)胞、操作步驟過(guò)于簡(jiǎn)單、沉淀時(shí)間較短等引起的RNA質(zhì)量較差。月桂酸鈉是一種生物降解性良好的陰離子表面活性劑，將其作為提取緩沖液能將植物組織中存在的多糖、色素和多酚等次生物質(zhì)進(jìn)行洗脫[26]，但應(yīng)用于酒醅中時(shí)卻無(wú)法有效提取到RNA以及去除雜質(zhì)，這可能需要結(jié)合液氮研磨提取效果才會(huì)更佳。Trizol試劑可直接從組織或細(xì)胞中提取總RNA，能迅速裂解細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出來(lái)的核糖核酸酶，從而保護(hù)RNA的完整性[27]，是一種操作簡(jiǎn)單便捷的方法，但在本研究中，Trizol法對(duì)酒醅進(jìn)行總RNA提取時(shí)，所得的雜質(zhì)污染較嚴(yán)重。而本研究中選用的試劑盒為目前市場(chǎng)上流行的E.Z.N.A.TMSoil RNA Kit（Omega）試劑盒[12,28-31]，其通過(guò)渦旋珠磨技術(shù)與苯酚-氯仿萃取相結(jié)合從樣品中分離RNA[32]，再通過(guò)離心柱和洗脫液去除DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，既能有效去除雜質(zhì)又同時(shí)具有濃縮功能，因而能獲得濃度高、純度好的RNA。本研究建立的SDS-苯酚法通過(guò)結(jié)合酒醅獨(dú)特的預(yù)處理方法，包括CaCl2去除腐殖質(zhì)、PVP沉淀多糖多酚等在抽提前去除大量雜質(zhì)，再通過(guò)磷酸鹽緩沖液對(duì)酒醅進(jìn)行除雜和收集細(xì)胞沉淀，排除大部分雜質(zhì)的干擾，有利于提升總RNA提取純度[33]；同時(shí)完善了SDS提取液配方，即在提取液中添加β-巰基乙醇，可以防止酚氧化，有助于去除蛋白質(zhì)[18]；并用常見(jiàn)的渦旋儀代替原方法[19]中昂貴的核酸裂解儀，可供更多的實(shí)驗(yàn)室選用。

已有的R N A 提取方法評(píng)價(jià)主要集中于R N A 提取效率，如濃度及純度、RT-P C R 檢測(cè)等方面的比較[6,20-24,27,32,34]，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的比較研究較少。針對(duì)兩種不同時(shí)間酒醅的微生物結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，方法本身對(duì)特定微生物專一偏好性很小。兩種酒醅中共計(jì)檢測(cè)到3 個(gè)綱、7 個(gè)屬，Trizol法偏好性地提取到1 個(gè)綱、1 個(gè)屬，占所有原核微生物類群僅為0.01%，試劑盒法偏好性地提取到1 個(gè)屬，占所有原核微生物類群也僅為0.01%。其中原因可能是3 種方法均采用了劇烈振蕩破碎細(xì)胞的方法提取RNA，這一方法能將所有微生物細(xì)胞裂解并提取RNA[19]，因此3 種方法本身的專一偏好性并不明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)3 種RNA提取方法所得微生物組成和相對(duì)豐度并不完全相同，但3 種方法均能檢測(cè)到兩種酒醅中的優(yōu)勢(shì)微生物類群，并且能反映這些優(yōu)勢(shì)微生物類群在兩種酒醅中的變化規(guī)律。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種改良的SDS-苯酚法，并比較了其與試劑盒法、Trizol法、CTAB法和月桂酸鈉法提取濃香型白酒酒醅總RNA的效果，其中：1）SDS-苯酚法和CTAB法成本較低，試劑盒法耗時(shí)最短但成本最高；2）5 種總提取方法所得RNA質(zhì)量濃度為：試劑盒法＞SDS-苯酚法＞Trizol法＞月桂酸鈉法＞CTAB法；3）SDS-苯酚法和試劑盒法提取樣品總RNA的純度較高，且SDS-苯酚法電泳條帶完整性優(yōu)于其他方法；4）SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提取的RNA能有效地用于反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)及高通量測(cè)序分析；5）RNA提取方法及樣品特性均會(huì)對(duì)酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性解析的結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響，如SDS-苯酚法獲得的微生物多樣性明顯高于其他兩種方法，以及7 d和15 d酒醅間微生物類群存在差異，且SDS-苯酚法和Trizol法能較好地反映出這種差異。

綜上所述，本研究系統(tǒng)地比較了5 種常見(jiàn)的總RNA提取方法在濃香型酒醅RNA提取的應(yīng)用效果，其中改良的SDS-苯酚法具有一定的綜合優(yōu)勢(shì)，為今后以RNA為基礎(chǔ)的酒醅分子生物學(xué)研究提供了理論依據(jù)及方法借鑒。