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    沙門氏菌噬菌體LPST144尾纖維gp38的序列分析及其結(jié)合活性

    2021-01-20 08:16:24楊其樂丁一峰聶若男李亞萌王小紅
    食品科學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:噬菌體沙門氏菌宿主

    楊其樂,丁一峰,張 宇,聶若男,李亞萌,王 佳,王小紅

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    沙門氏菌是導(dǎo)致食源性疾病的主要病原菌,在全球范圍內(nèi),每年約造成9 380萬 例腸胃炎疾病,以及15.5萬 人死亡[1]。沙門氏菌是一類革蘭氏陰性短桿菌,需氧或兼性厭氧,腸桿菌科沙門氏菌屬,由腸炎沙門氏菌種和邦戈沙門氏菌種組成[2-3]。沙門氏菌分布廣泛,菌型繁多,目前使用標(biāo)準(zhǔn)Kauffman-White方案已鑒定超過2 600 種血清型,而大多數(shù)血清型能夠在包括人類在內(nèi)的多種動(dòng)物宿主中寄生,其中腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌是導(dǎo)致人畜共患病的兩種主要血清型[4]。近年來,抗生素的大量使用導(dǎo)致了耐藥性沙門氏菌的出現(xiàn),耐藥沙門氏菌的強(qiáng)毒力、高死亡率引起了廣泛關(guān)注[5]。因此,為預(yù)防沙門氏菌對(duì)人類健康以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成重大危害,對(duì)其進(jìn)行有效的安全監(jiān)控和監(jiān)督、建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有重要意義。

    噬菌體作為一種細(xì)菌病毒,能夠特異性吸附、侵染細(xì)菌并完成自我復(fù)制[6],最早發(fā)現(xiàn)于一個(gè)世紀(jì)以前,用于對(duì)分子生物學(xué)基本原理的探究[7]。在自然環(huán)境中,噬菌體幾乎無處不在,海洋、土壤、深海噴口以及飲用水、食物中都存在噬菌體。同時(shí),噬菌體也是地球上數(shù)量最多的生物體,其數(shù)目約為1030~1031,且具有多樣性[8]。噬菌體侵染細(xì)菌,完成其生命周期的第一步是特異性識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌表面受體,其主要識(shí)別的細(xì)菌表面受體為脂多糖和細(xì)菌表面蛋白上特定的殘基[9],噬菌體顆粒中承擔(dān)這一重要功能的蛋白被稱為受體結(jié)合蛋白(receptor binding proteins,RBPs),存在于噬菌體尾纖維或者尾刺的末端[10-12]。由于RBPs介導(dǎo)的宿主識(shí)別是高度特異性的,因此,可以利用RBPs作為分子識(shí)別元件進(jìn)行宿主菌的特異性檢測(cè)技術(shù)研究[13-14]。

    目前報(bào)道較多的噬菌體RBPs有:T4 gp37、gp12;T2 gp38;P22 gp9和T7 gp17[15-16]。一般而言,RBPs具有如下特點(diǎn):具有模塊化性質(zhì),N端連接噬菌體粒子主體,序列同源性較高,C端為受體識(shí)別區(qū)決定宿主范圍,序列相似度較低;許多已知的RBPs受體識(shí)別區(qū)富含β結(jié)構(gòu),通常會(huì)形成三聚體且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[16-17];許多尾刺蛋白還具有水解活性,目前已知的具有水解活性的尾刺蛋白已被鑒定有215 個(gè),這些RBPs能夠降解脂多糖、磷壁酸等生物聚合物,為噬菌體進(jìn)入細(xì)胞膜注入DNA掃清道路[17];一個(gè)噬菌體可以有多個(gè)RBPs,例如T4噬菌體具有短尾纖維(gp12)和長(zhǎng)尾纖維(gp37)[18],且在吸附過程中承擔(dān)著不同的功能,T4噬菌體與宿主菌靠近后,長(zhǎng)尾纖維(gp37)識(shí)別連接細(xì)菌表面一級(jí)受體,此時(shí)的結(jié)合可逆,隨后T4噬菌體在細(xì)菌表面依靠長(zhǎng)尾纖維移動(dòng),當(dāng)周圍有2~3 個(gè)一級(jí)受體并與之相連后,信號(hào)傳遞導(dǎo)致底板構(gòu)象改變,釋放短尾纖維(gp12),其不可逆地結(jié)合宿主二級(jí)受體,最后尾部收縮,注入噬菌體DNA[19]。由于RBPs具有以上特點(diǎn),將其用作檢測(cè)探針有以下優(yōu)點(diǎn):易于大量獲得;RBPs具有模塊化的性質(zhì),可將受體結(jié)合區(qū)分離,改造優(yōu)化,可將具有不同宿主范圍的RBPs融合表達(dá),擴(kuò)大宿主范圍[20-21];與易發(fā)生重組和突變的完整噬菌體粒子相反,克隆原性在生產(chǎn)過程中保持不變,性質(zhì)穩(wěn)定,更適于商業(yè)化[16,22]。同時(shí)RBPs的一些性質(zhì)也導(dǎo)致了研究的困難:首先,RBPs序列多樣性大,受體識(shí)別區(qū)序列相似性低,且一種噬菌體可能同時(shí)具有一種或者一種以上的RBPs[23],這些特點(diǎn)導(dǎo)致生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的困難[24];其次,了解噬菌體RBPs的結(jié)構(gòu)能極大促進(jìn)噬菌體識(shí)別機(jī)制理論的發(fā)展,而尾纖維的柔性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致結(jié)晶困難,因此對(duì)結(jié)構(gòu)研究和識(shí)別機(jī)制理論的揭示和發(fā)展造成了巨大的挑戰(zhàn)[25]。

    本研究分析實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的1 株沙門氏菌噬菌體LPST144尾纖維gp38的理化性質(zhì)、遺傳進(jìn)化關(guān)系和二級(jí)結(jié)構(gòu),旨在完成尾纖維基因orf38異源表達(dá)純化以及其特異性結(jié)合活性的驗(yàn)證,為后續(xù)開發(fā)基于噬菌體RBPs為分子探針建立沙門氏菌檢測(cè)方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    噬菌體LPST144由實(shí)驗(yàn)室前期分離保存,為1 株鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimuriumATCC13311)烈性噬菌體,短尾科,T7類噬菌體;已完成其基因組測(cè)序,GenBank登錄號(hào)為MN252582;鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311(S. typhimuriumATCC13311)、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028(S. typhimuriumATCC14028)、鼠傷寒沙門氏菌ST-8(S. typhimuriumST-8)、鼠傷寒沙門氏菌UK-1(S. typhimuriumUK-1)、腸炎沙門氏菌SJTUF10978(S. enteritidisSJTUF10978)、腸炎沙門氏菌SJTUF10984(S. enteritidisSJTUF10984)、腸炎沙門氏菌10960(S. enteritidis10960)、金黃色葡萄球菌6538(Staphylococcus aureus6538)和大腸桿菌T10(Escherichia coliT10)為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;沙門氏菌外膜蛋白Ompc為實(shí)驗(yàn)室異源表達(dá)純化得到。

    根據(jù)噬菌體LPST144基因組注釋結(jié)果,設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增orf38基因序列,引物序列如下:orf38F:5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’,orf38R:5’-CCGCTCGAGCGGATAGAAGTAGTGAAT-3’(下劃線分別代表BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、聚會(huì)酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物回收試劑盒 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;質(zhì)粒pSmart-I、E.coliBL21 美國(guó)Addgene公司;HisPur Ni-NTA Resin蛋白純化樹脂 美國(guó)Thermo Fisher公司;BCA蛋白定量試劑盒 默克生命科學(xué);鼠抗組氨酸抗體、山羊抗鼠抗體 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;脫脂奶粉 美國(guó)BD-Difco公司;9018型酶標(biāo)板 美國(guó)康寧公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    5417R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特公司;BSO-130011A2超凈臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HNY-2102C全溫振蕩培養(yǎng)箱 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

    1.3 方法

    1.3.1 噬菌體LPST144 gp38序列理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化分析

    通過在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)gp38序列的理化性質(zhì),包括等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和親水系數(shù);使用軟件DNAMAN作多序列比對(duì);使用NCBI CDD和Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)序列保守結(jié)構(gòu)域;通過在線工具PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)gp38序列的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用NCBI BLAST工具查找GenBank數(shù)據(jù)庫中與gp38具有相似性的序列,并使用MEGA7繪制進(jìn)化樹(Tree method:Maximum likelihood;Max Seq Difference:0.85;Distance:Grishin)。實(shí)驗(yàn)涉及到的尾纖維同源序列包括:LPST144(QEP53513);BP12A(YP_009303689);phiSG-JL2(YP_001949790);SH2(YP_009289339);SH1(YP_009289339);phiIBBPF7A(YP_004306354);Pf-10(YP_009145638);Ebrios(AVJ51925);Kvp1(YP_002308420);Patroon(QBQ72909);fPS-21(SOO46777);fPS-9(SOL37536);fPS-19(SOO46422);fPS-89(SOO46625);vB_KpnP_NahiliMali(QEG13382.1);fPS-10(SOO46575.1);vB_KpnP_Sibilus(QEG12954.1);fPS-59(SOO46827);vB_KpnP_Emp27(QEG11854.1);E-2(YP_009226215);2050H2(ASZ79018);phiYeO3-12(NP_052117);T7(AAM43539);13a(YP_002003979);YpsP-G(AFK13534);T3(NP_523342);phiA1122(NP_848304)。

    1.3.2 尾纖維基因orf38的克隆以及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

    以噬菌體LPST144的基因組為模板,設(shè)計(jì)引物orf38F(5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’)、orf38R(5’-CCGCTCGAGCGGATAGA-AGTAGTGAAT-3’)(下劃線分別代表BamH I和XhoI酶切位點(diǎn))擴(kuò)增目的基因orf38。使用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pSmart-I,參照TaKaRa公司的BamH I和XhoI說明書,配制酶切體系并選擇最佳酶切條件。按照QIAquick Gel Extraction Kit操作說明書對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收,根據(jù)T4 DNA連接酶的說明書,將目的基因與質(zhì)粒pSmart-I的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體,然后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒后用EcoR I和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定,將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送至公司測(cè)序。

    1.3.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

    挑取陽性單克隆接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。取1 mL轉(zhuǎn)接于100 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值為0.6~0.8左右。吸取1 mL未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照,在剩余的菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)(終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo),將加入IPTG后的菌液分別按下列條件進(jìn)行培養(yǎng):16 ℃培養(yǎng)12 h,37 ℃培養(yǎng)12 h,16 ℃培養(yǎng)4 h以及37 ℃培養(yǎng)4 h。收集不同表達(dá)條件的樣品,12 000 r/min離心15 min收集菌體。用10 mL的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)重懸菌體,超聲破碎細(xì)胞(功率200 W),超聲時(shí)間2 s,間隔2 s,總計(jì)40 min,之后12 000 r/min離心10 min收集上清液。分別取10 μL樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)驗(yàn)證表達(dá)情況。

    取上述最佳表達(dá)條件下的上清液樣品,采用HisPur Ni-NTA樹脂親和層析純化目的蛋白,取1 mL親和樹脂裝柱,鎳柱用PBS平衡后,加入破碎后的上清樣品過柱,分別使用含有50、300 mmol/L咪唑的PBS洗去雜蛋白,并洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白透析處理,在0.01 mol/L PBS中,4 ℃過夜去除咪唑。將透析后的蛋白樣品利用10 kDa超濾管濃縮,4 000 r/min低溫離心30 min,棄去濾出液。將最終截留的蛋白樣品分裝置于-20 ℃保存,取5 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。采用BCA蛋白定量試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

    1.3.4 重組蛋白的活性檢測(cè)

    將宿主鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311培養(yǎng)至OD600nm值為0.8~1.2,平板計(jì)數(shù),離心收集菌體,用1 mL無菌PBS將菌體懸浮于離心管,終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的甲醛滅活,4 ℃過夜;將滅活后的菌體用無菌PBS洗滌4 次,并以無菌PBS調(diào)整菌濃度至107CFU/mL,取100 μL宿主菌和其他6 株不同血清型的沙門氏菌(鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌ST-8、鼠傷寒沙門氏菌UK-1、腸炎沙門氏菌SJTUF10978、腸炎沙門氏菌SJTUF10984、腸炎沙門氏菌10960)包被于96 孔板,同時(shí)包被100 μL 5 μg/mL沙門氏菌外膜蛋白、100 μL 107CFU/mL滅活后的金黃色葡萄球菌6538和大腸桿菌T10以及100 μL PBS對(duì)照,4 ℃過夜;加入300 μL 3%脫脂牛奶于37 ℃封阻2 h,用PBST(含0.05%吐溫20的PBS)洗滌5 次后每孔加入100 μL 0.05 mg/mL的gp38蛋白(加100 μL PBS作為對(duì)照),37 ℃孵育1 h,再依次加入50 μL 0.2 μg/mL鼠抗組氨酸抗體(一抗)、50 μL 0.2 μg/mL山羊抗鼠抗體(二抗),每一步之間用PBST洗滌5 次。然后加入底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺在37 ℃顯色15 min,最后加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng),并在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,每次設(shè)3 個(gè)平行。運(yùn)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪圖和分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析(P<0.05,差異顯著)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 尾纖維蛋白gp38基本理化性質(zhì)分析

    利用ProtParam工具對(duì)gp38序列理化性質(zhì)進(jìn)行分析,gp38由646 個(gè)氨基酸組成,等電點(diǎn)為5.94。不穩(wěn)定系數(shù)為22.37,親水系數(shù)為-0.368。一般而言,不穩(wěn)定系數(shù)小于40表明該蛋白較為穩(wěn)定,親水系數(shù)為負(fù)值表明該蛋白具有一定的親水性。從圖1可見,gp38的氨基酸中含量最高的是丙氨酸(A),占全部氨基酸的11.5%,甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、精氨酸(R)和天冬酰胺(N)含量較高,占比在6.5%~9.4%之間,含量最低的是半胱氨酸(C),占全部氨基酸的0.5%。非極性氨基酸占比為39.8%,極性氨基酸的占比較高為60.2%,其中帶正電荷的極性氨基酸(K+R+H)有82 個(gè),占12.7%,帶負(fù)電的極性氨基酸(D+E)有74 個(gè),占11.4%,其余的極性氨基酸為233 個(gè),占36.1%。

    圖1 噬菌體LPST144尾纖維gp38氨基酸組成Fig. 1 Amino acid compositions of phage LPST144 tail fiber gp38

    2.2 尾絲蛋白gp38的遺傳進(jìn)化分析

    將噬菌體LPST144 gp38的氨基酸序列與NCBI nr數(shù)據(jù)庫做BLAST比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果,選擇相似度較高的序列用于后續(xù)的進(jìn)化分析。如圖2所示,噬菌體LPST144與噬菌體BP12A單獨(dú)聚為一簇,相似度最高、親緣關(guān)系最近,而與其他噬菌體T7、T3等親緣關(guān)系明顯較遠(yuǎn),表明噬菌體LPST144和BP12A的尾纖維在序列上與nr數(shù)據(jù)庫中其他噬菌體的尾纖維具有明顯的差異。

    圖2 噬菌體LPST144尾纖維gp38的遺傳進(jìn)化分析Fig. 2 Genetic evolution analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

    根據(jù)圖2結(jié)果,選擇親緣關(guān)系不同的8 種噬菌體尾纖維(表1)進(jìn)一步比對(duì)分析。如圖3A所示,序列比對(duì)結(jié)果顯示N端保守性較好,同時(shí)在該區(qū)域預(yù)測(cè)到兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別是:1~261位尾纖維蛋白,CDD數(shù)據(jù)庫索引號(hào)為cl28018;279~331位噬菌體尾部領(lǐng)狀區(qū)域,Pfam數(shù)據(jù)庫索引號(hào)為pfam07484;而C端序列變異度較大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,噬菌體尾纖維的N端通常與噬菌體主體連接,C端負(fù)責(zé)結(jié)合宿主菌,宿主菌表面受體的多樣性導(dǎo)致C端序列的多樣性[26]。前期工作中鑒定了T7與LPST144同屬于Teseptimavirus屬,T7噬菌體的尾纖維gp17與噬菌體LPST144的尾纖維gp38的氨基酸序列相似度為41%,覆蓋率為54.21%。Garcia-Doval等[27]于2012年對(duì)T7噬菌體尾纖維gp17 C端377~533位進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析,結(jié)果表明T7噬菌體gp17最后84 個(gè)氨基酸(470~553位)由8 個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)(B~I(xiàn))和無規(guī)卷曲組成,形成4 個(gè)主要環(huán)狀結(jié)構(gòu)(BC、DE、FG和HI環(huán)),構(gòu)成T7噬菌體尾纖維尖端結(jié)構(gòu)域的一個(gè)單體,是識(shí)別和結(jié)合宿主菌受體的關(guān)鍵序列。因此將這一部分區(qū)域進(jìn)一步比對(duì)分析,結(jié)果如圖3B所示,總體來看,LPST144與BP12A尾纖維序列匹配非常好,在這一區(qū)間內(nèi)僅有兩個(gè)堿基的差異,而與phiSGJL2、SH1、SH2和T7、YpsP-G、T3、phiA1122,分為3 組,組內(nèi)各自匹配度較好,驗(yàn)證了圖2進(jìn)化分析的結(jié)果,另一方面,由于各組之間序列差異大,未找到整體的核心保守區(qū)。

    表1 噬菌體LPST144尾纖維gp38的同源性分析Table 1 Homology analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

    噬菌體T7 gp17的C末端富含β-折疊的區(qū)域是受體識(shí)別結(jié)合關(guān)鍵區(qū),目前已知其520位的天冬氨酸(D)突變?yōu)楣劝彼幔‥)后可裂解E. coliB,544位的纈氨酸(V)突變?yōu)楸彼幔ˋ)后可裂解E. coliK12[28],高同源性噬菌體phiA1122尾纖維523位亮氨酸(L)突變?yōu)榻z氨酸(S)后,其宿主譜也發(fā)生了改變[29](圖3B下劃線標(biāo)記處)。通過分析比較LPST144 gp38 C末端的二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)同樣存在大量的β-折疊結(jié)構(gòu),推測(cè)這些富含β-折疊的區(qū)域可能與宿主表面受體的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)。不同的是T7 gp17的金字塔結(jié)構(gòu)和頂端結(jié)構(gòu)之間由1 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)連接,頂端結(jié)構(gòu)由8 個(gè)β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)組成,gp38的C末端由12 個(gè)β-折疊(a~n)結(jié)構(gòu)組成,緊接的是1 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)(o)。T7 gp17具有2 個(gè)半胱氨酸(C),不形成二硫鍵,gp38具有3 個(gè)半胱氨酸(C),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示同樣未形成二硫鍵。另一方面,前期工作中已經(jīng)鑒定了LPST144與BP12A屬于兩個(gè)不同的物種(未發(fā)表),理論上兩者的宿主范圍會(huì)有一定的差異,其gp38 C末端與噬菌體BP12A尾纖維C末端高度相似,僅有2 個(gè)氨基酸(533位和612位)的差異(圖3B方框標(biāo)記位點(diǎn)),推測(cè)這2 個(gè)位點(diǎn)可能是受體識(shí)別和結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

    圖3 噬菌體LPST144尾纖維gp38序列比對(duì)分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

    2.3 尾纖維基因orf38的克隆以及重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38的構(gòu)建

    圖4 重組質(zhì)粒pSmart-I-gp38雙酶切電泳圖Fig. 4 Electrophoresis profile of recombinant plasmid pSmart-I-gp38 after double enzyme digestion

    以噬菌體LPST144的基因組序列為模板,設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增目的基因,使用限制酶BamH I和Xho I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pSmart-I空質(zhì)粒,使用T4連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38。采用Xho I和EcoR I對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定,結(jié)果如圖4所示,酶切產(chǎn)物中包括目的條帶(約2 100 bp)和載體條帶(約5 400 bp)。同時(shí)根據(jù)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果,表明基因orf38正確插入載體pSmart-I中,重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38構(gòu)建成功。

    2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

    重組表達(dá)載體pSmart-I-gp38轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21后,使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并探究在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)效果。從圖5A可知,在80 kDa左右出現(xiàn)預(yù)期目的條帶,目的蛋白為82.89 kDa。另外,37 ℃誘導(dǎo)4 h上清蛋白表達(dá)效果最佳,目的條帶明顯,雜帶淺,因此確定選擇37 ℃誘導(dǎo)4 h,并選擇上清蛋白作為目的蛋白源進(jìn)行純化。重組蛋白純化結(jié)果如圖5B所示,可知在75~100 kDa之間出現(xiàn)目標(biāo)條帶,經(jīng)BCA試劑盒定量測(cè)定其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

    圖5 gp38蛋白的表達(dá)與純化Fig. 5 SDS-PAGE profiles of expressed and purified gp38 protein

    2.5 重組蛋白gp38的活性

    將宿主沙門氏菌ATCC13311加入酶標(biāo)板過夜,使其附著在酶標(biāo)板上;脫脂牛奶封阻后加入gp38蛋白進(jìn)行孵育;然后依次加入一抗、二抗和底物進(jìn)行顯色,加入濃硫酸終止反應(yīng),檢測(cè)重組蛋白的結(jié)合活性。結(jié)果表明(圖6),實(shí)驗(yàn)組(加gp38蛋白)的吸光度為0.94±0.02,極顯著高于陰性對(duì)照(PBS代替gp38蛋白)的吸光度0.17±0.01,表明gp38蛋白具有受體結(jié)合活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證gp38蛋白的結(jié)合特異性,分別用大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白、金黃色葡萄球菌6538和PBS代替宿主沙門氏菌ATCC13311作為對(duì)照組,并測(cè)試其他6 株不同血清型的沙門氏菌。如圖7所示,對(duì)照組吸光度分別為0.58±0.03、0.56±0.01、0.59±0.03、0.53±0.005,實(shí)驗(yàn)組(包括宿主在內(nèi)的7 株沙門氏菌組)的吸光度較各對(duì)照組明顯更高,且gp38蛋白與大腸桿菌T10、金黃色葡萄球菌6538和外膜蛋白的結(jié)合較PBS無明顯差異,表明LPST144尾纖維gp38具有特異的受體結(jié)合活性。

    圖6 重組蛋白gp38對(duì)宿主菌的結(jié)合活性Fig. 6 Binding activity of recombinant protein gp38 to host cells

    圖7 重組蛋白gp38的特異性結(jié)合活性Fig. 7 Specific binding activity of recombinant protein gp38

    3 討 論

    沙門氏菌噬菌體LPST144是本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的1 株短尾科噬菌體,其吸附時(shí)間短,9 min便達(dá)到最大吸附量77.57%,具有用于沙門氏菌快速檢測(cè)方法開發(fā)的潛力。通過測(cè)序分析,鑒定其與T7噬菌體同屬于Teseptimavirus屬,預(yù)測(cè)了其尾纖維gp38(發(fā)表中),本研究對(duì)其尾纖維進(jìn)行了進(jìn)一步的序列分析和活性鑒定。目前已知晶體結(jié)構(gòu)信息的尾纖維或尾刺數(shù)量非常有限,現(xiàn)已有報(bào)道的RBPs晶體結(jié)構(gòu)有短尾科噬菌體P22的尾刺gp9[30]、T4噬菌體的gp37[31]以及T7噬菌體的尾纖維gp17[27],通過對(duì)LPST144 gp38進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)LPST144尾纖維gp38與T7噬菌體尾纖維gp17的N端序列具有較好的相似性,C端相似性卻極差。并通過遺傳進(jìn)化、多序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)其滿足RBPs的以下特征:具有模塊化的性質(zhì),N端保守性強(qiáng)而C端多樣性大;C端富含β折疊結(jié)構(gòu);序列相似性低。將其C端序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì),發(fā)現(xiàn)僅與BP12A的尾纖維具有較好的相似性,而與其他序列同源性不高。BP12A為1 株沙門氏菌噬菌體,GenBank登錄號(hào)為KM366096,經(jīng)基因組比較鑒定,其與噬菌體LPST144是2 個(gè)不同的物種,理論上宿主范圍存在一定差異,而兩者的尾纖維C端僅有兩個(gè)位點(diǎn)(533位和612位)的差異,因此推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)可能是受體結(jié)合關(guān)鍵氨基酸。由于PDB數(shù)據(jù)庫中缺乏能夠滿足同源建模要求的結(jié)構(gòu)模板,而采用從頭計(jì)算的方法預(yù)測(cè)得到的三維結(jié)構(gòu)未能通過評(píng)估,因此未能得到gp38三維結(jié)構(gòu),而LPST144的尾纖維與其他噬菌體(除噬菌體BP12A)的尾纖維幾乎沒有相似性,因此未來有必要對(duì)其空間構(gòu)象進(jìn)行解析,為擴(kuò)寬其宿主譜提供指導(dǎo)依據(jù)。

    目前報(bào)道的常用于沙門氏菌檢測(cè)的RBPs有短尾科噬菌體P22的尾刺gp9[17]和肌尾科噬菌體S16的尾纖維gp38[32],本研究對(duì)短尾科噬菌體LPST144的尾纖維進(jìn)行異源表達(dá),驗(yàn)證了尾纖維gp38的特異性結(jié)合能力。在異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,最初使用的表達(dá)質(zhì)粒為pET28b,由于表達(dá)產(chǎn)物溶解性差形成包涵體,于是在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用了攜帶His標(biāo)簽和SUMO標(biāo)簽的促融表達(dá)質(zhì)粒pSmart-I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,增加SUMO標(biāo)簽?zāi)茱@著提高目的蛋白的溶解性。通過考察確定最佳的誘導(dǎo)條件為37 ℃誘導(dǎo)4 h,純化后測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。在目的蛋白結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)中,gp38蛋白加入后的吸光度較陰性對(duì)照明顯提高,表明了gp38蛋白對(duì)于宿主菌具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。在驗(yàn)證其特異性結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)gp38對(duì)于宿主菌以及其他6 株受試的不同血清型沙門氏菌較大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白、金黃色葡萄球菌6538和PBS代替宿主菌對(duì)照組的吸附明顯更強(qiáng),而包被大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白和金黃色葡萄球菌6538組與PBS代替宿主菌對(duì)照組無顯著性差異,表明了gp38蛋白的結(jié)合特異性,相比于常見的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對(duì)照組的吸光度偏高,推測(cè)這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于gp38重組蛋白N端的SUMO標(biāo)簽未切割所造成,產(chǎn)生了一定的非特異性結(jié)合。通常情況下,重組表達(dá)蛋白的活性受到表達(dá)條件(溫度、pH值等)、表達(dá)菌株和表達(dá)過程中重組蛋白是否正確折疊等諸多因素的影響,因此,后期還有待對(duì)這樣因素加以考慮并優(yōu)化條件,針對(duì)這一問題進(jìn)行改進(jìn)。通常RBPs的宿主范圍會(huì)與完整噬菌體顆粒相當(dāng)或者更為廣泛,沙門氏菌血清型眾多,目前已分離鑒定2 600多種,同時(shí)可大規(guī)模測(cè)定gp38結(jié)合的宿主范圍,以明確檢測(cè)的對(duì)象范圍。已知目前報(bào)道的用于沙門氏菌的分子探針P22 gp9和S16 gp38對(duì)部分其他血清型鼠傷寒沙門氏菌作了測(cè)試,而鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311均未被測(cè)試,一般來講,由于RBPs的序列差異大,且沙門氏菌血清型眾多(目前已發(fā)現(xiàn)超過2 600 個(gè)沙門氏菌血清型),能夠結(jié)合的宿主范圍差異也會(huì)很大。另一方面,本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)初步的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),其目的在于證明gp38具有RBPs特異性結(jié)合活性,具有作為檢測(cè)探針的潛力,后期課題組將進(jìn)一步優(yōu)化gp38重組表達(dá)和活性研究并開發(fā)檢測(cè)方法。一般來說檢測(cè)靈敏度是針對(duì)檢測(cè)體系的建立,因此目前未能進(jìn)行靈敏度的比較。

    4 結(jié) 論

    迄今為止,沙門氏菌感染仍然是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題,每年沙門氏菌的感染事件給人類健康以及經(jīng)濟(jì)社會(huì)造成重大負(fù)擔(dān),噬菌體作為細(xì)菌的天敵,能夠特異性吸附并侵染宿主菌,給沙門氏菌的檢測(cè)提供了新的思路。本研究對(duì)短尾科沙門氏菌噬菌體LPST144的尾纖維基因orf38進(jìn)行研究,預(yù)測(cè)了其序列和結(jié)構(gòu)信息,通過異源表達(dá)純化,驗(yàn)證了gp38具有特異性結(jié)合宿主沙門氏菌以及實(shí)驗(yàn)中其他受試沙門氏菌的能力,為開發(fā)基于噬菌體RBPs為分子探針建立沙門氏菌的檢測(cè)方法奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)也為理解噬菌體與宿主菌的相互作用提供了依據(jù)。

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