pH 值對(duì)醬油中呈味肽種類和呈味特性的影響

汪 卓，陳楚銳，許立鏘，莊沛銳，周文斯，崔 春,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 521000）

醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為原料，輔以面粉、小麥、麩皮等淀粉質(zhì)原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵作用，生產(chǎn)出的一種含有多種氨基酸、呈味肽、有機(jī)酸和還原糖且具有特殊色、香、味的調(diào)味品[1-4]。醬油的滋味鮮美，主要是由于大豆蛋白或小麥蛋白在發(fā)酵酶解過(guò)程中分解產(chǎn)生了大量的呈味肽和游離氨基酸[5]。

呈味肽是指能夠改善或掩蓋食品感官特性的寡肽類，其分子質(zhì)量一般低于5 000 Da[6]。目前，已知的呈味肽主要有咸味肽、酸味肽、甜味肽、苦味肽、鮮味肽以及濃厚感肽[7-8]。其中，鮮味肽和濃厚感肽是醬油中重要的呈味肽[9-10]。鮮味肽可以減弱苦味，具有顯著的增鮮、增香作用；濃厚感肽能夠顯著增加食物濃厚感、口感復(fù)雜性及豐富性等。呈味肽的呈味特性與其相對(duì)分子質(zhì)量，氨基酸組成、氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)等有關(guān)[11-14]。因此，研究醬油中的呈味肽，并對(duì)呈味肽的分子質(zhì)量及氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定分析，有助于進(jìn)一步探究醬油中的呈味物質(zhì)及其呈味機(jī)理。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高鹽稀態(tài)醬油釀造前期對(duì)醬醪進(jìn)行低溫脅迫處理可促進(jìn)米曲霉自溶；提高醬醪中蛋白酶和谷氨酰胺酶活力，谷氨酸含量明顯增加；提升了醬油原油的鮮味[15]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用固相萃取（solid phase extraction，SPE）法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)研究發(fā)酵pH值對(duì)低溫脅迫法生產(chǎn)醬油中呈味肽種類和呈味特性的影響，以期為高品質(zhì)醬油的生產(chǎn)提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Oasis MAX混合型陰離子SPE柱（6 mL/500 mg）美國(guó)Waters公司；甲酸、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、氨水、甲酸（均為色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷（色譜純）天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E分析天平 梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司；TS100微型旋渦混合儀器 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；HL-6恒流泵 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；UPLCMS/MS聯(lián)用儀 美國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫脅迫醬油的制備

將已浸潤(rùn)的豆粕高溫滅菌后與大曲混合，置于霉菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行制曲。將所得大曲平均分為2 份，第1份按大曲、水質(zhì)量比為1∶2.5混合均勻后，醬醪發(fā)酵初期9 d放在4 ℃冰箱進(jìn)行控溫發(fā)酵，之后與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%的鹽水以1∶3.05質(zhì)量比混合，使最終醪液的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到16%，并放在25 ℃的恒溫發(fā)酵箱進(jìn)行保溫發(fā)酵，每2～3 d用10 mol/L NaOH溶液調(diào)控醬醪pH 6.5左右，發(fā)酵90 d，得到調(diào)控pH值醬醪；第2份所有發(fā)酵條件均與第1份相同，但不調(diào)節(jié)pH值，發(fā)酵90 d，得到自然pH值醬醪。

1.3.2 SPE技術(shù)分離呈味肽

收集兩組醬油樣品，離心過(guò)濾，分別取0.3 mL稀釋于50 mL蒸餾水中。

參考Frerot等[16]的方法并稍作修改。采用Oasis MAX混合型陰離子SPE柱分離兩組醬油樣品中的鮮味肽和濃厚感肽，操作參數(shù)見(jiàn)表1。洗脫出的酸性組分經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于樣品瓶中，4 ℃低溫保存。

1.3.3 UPLC分離待測(cè)樣品

參考Frerot等[16]的UPLC分離條件并稍作修改。分離柱為C18柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL。梯度洗脫條件如表2所示。

表2 UPLC的梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions for ultra-high performance liquid chromatography

1.3.4 質(zhì)譜鑒定呈味肽

醬油樣品經(jīng)UPLC分離后，分流通過(guò)電噴霧界面，進(jìn)入高分辨質(zhì)譜儀。采用電噴霧電離正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 000。采用高純度氮?dú)庾鳛殪F化氣和干燥氣，干燥溫度180 ℃，干燥氣流速4.0 L/min。依據(jù)從頭測(cè)序法和自動(dòng)數(shù)據(jù)搜索法，對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行離子碎片解析，從而推導(dǎo)出m/z 50～1 000多肽的氨基酸序列。

1.3.5 定向合成呈味肽

經(jīng)1.3.1～1.3.3節(jié)分離且鑒定出目標(biāo)呈味肽，由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司進(jìn)行定向合成，合成的呈味肽純度均在95%以上。

1.3.6 呈味肽的基本感官呈味分析

采用定量描述分析[17]方法。參照GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則 第1部分：優(yōu)選評(píng)價(jià)員》的方法。男性7 名和女性5 名，年齡25～45 歲，在（23±2）℃的感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)溶液為5 種，甜味（蔗糖，1 g/100 mL）、咸味（氯化鈉，0.7 g/100 mL）、鮮味（谷氨酸鈉，0.35 g/100 mL）、苦味（L-異亮氨酸，0.5 g/100 mL）、酸味（檸檬酸，0.08 g/100 mL）。合成多肽1 g/100 mL，感官評(píng)價(jià)采用九點(diǎn)線性標(biāo)度法，0～9 分，分別表示無(wú)感覺(jué)、閾值感覺(jué)、感覺(jué)微弱、感覺(jué)中等、感覺(jué)強(qiáng)烈，繪制圖表描述結(jié)果。

1.3.7 呈味肽的呈味閾值

合成呈味肽的閾值采用滋味稀釋分析法[17]進(jìn)行測(cè)定。合成呈味肽為1 g/100 mL，依據(jù)三角檢驗(yàn)（1 個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)組，2 個(gè)空白對(duì)照組），按照1∶1逐步稀釋。呈味肽的呈味閾值即為樣品實(shí)驗(yàn)組剛好與另外2 個(gè)空白對(duì)照組（純凈水）區(qū)分的質(zhì)量濃度，對(duì)各個(gè)感官品評(píng)員的結(jié)果取平均值。

1.3.8 呈味肽對(duì)醬油呈味的影響

空白對(duì)照組樣品為海天味業(yè)市售醬油，pH 4.75，氨態(tài)氮質(zhì)量濃度1.2 g/100 mL，評(píng)分為5 分。將合成呈味肽添加至空白對(duì)照組醬油溶液中，其質(zhì)量濃度為0.03 g/100 mL，評(píng)價(jià)其感官效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，使用OriginPro 9.0、Excel 2016和SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并繪制成相應(yīng)的圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同醬油pH值的變化規(guī)律

自然pH值和調(diào)控pH值醬油釀造過(guò)程中pH值的變化如圖1所示。醬醪發(fā)酵過(guò)程中，調(diào)控pH值醬醪的pH值始終維持在6.5左右，自然pH值醬醪的pH值呈現(xiàn)不斷下降的變化趨勢(shì)。醬醪發(fā)酵過(guò)程中，自然pH值醬醪的pH值一直降低，可能是由于微生物生長(zhǎng)代謝及其酶系進(jìn)行的復(fù)雜生化反應(yīng)，如乳酸菌生長(zhǎng)可利用葡萄糖和檸檬酸產(chǎn)生乳酸和乙酸，從而降低醬醪pH值。

調(diào)控pH值醬醪的發(fā)酵過(guò)程中，pH值處于中性和弱酸性，可以充分發(fā)揮米曲霉分泌的谷氨酰胺酶、中性蛋白酶的作用，對(duì)原料的蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，從而提高氨基酸、總氮的生成率，增加醬油中小分子肽含量，達(dá)到提升醬油感官滋味的目的[18]。調(diào)控醬醪pH值可以明顯改變醬醪的pH值環(huán)境，最終影響醬油的質(zhì)量。余自琳等[19]在pH 5.0～7.0反應(yīng)條件下對(duì)墨魚(yú)進(jìn)行酶解，隨著pH值升高，游離氨基酸總量升高，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物苦腥味減弱，鮮甜味突出?？禈?lè)等[20]研究了pH 5.0～6.5對(duì)牛肉酶解物美拉德風(fēng)味特性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，大分子肽段含量降低，小分子肽段含量上升，醇厚感顯著增加，說(shuō)明pH值的增大使肽類降解速率加快。

圖1 不同釀造工藝發(fā)酵90 d醬醪pH值的變化Fig. 1 Changes in pH during soy sauce moromi fermentation with and without pH adjustment for 90 days

2.2 SPE技術(shù)和UPLC-MS/MS分離鑒定醬油中的呈味肽

Oasis MAX是一種新穎的混合模式聚合物吸附劑，利用陰離子交換基團(tuán)提取酸性化合物及其代謝產(chǎn)物。谷氨酸、天冬氨酸等屬于酸性（鮮味）氨基酸，其側(cè)鏈R基團(tuán)為酸性基團(tuán)（如COOH、SO3H），能夠作為前體形成鮮味物質(zhì)。含有如谷氨酸和天冬氨酸等鮮味氨基酸殘基的寡肽，很可能具有顯著的鮮味[21]；而分子質(zhì)量小于1 kDa的γ-谷氨酰肽很可能為濃厚感肽，具有鮮味和輕微酸味[22-23]。因此，這些物質(zhì)很可能存在于呈酸性組分中。結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，分離鑒定醬油酸性組分中呈味肽的氨基酸序列，見(jiàn)表3、4。

結(jié)果表明，調(diào)控pH值和自然pH值醬油，多以小分子肽為主，經(jīng)過(guò)Oasis MAX SPE柱提取后，酸性組分中所鑒定出的多肽均以含有酸性氨基酸Glu和Asp的小肽為主，如EM、ED、EE、EDD、EF、LDP、ESAY、AELY、FLET等。此外，在調(diào)控pH值和自然pH值醬油中均鑒定出ED、EE、EDD、SV、EF、FLET、LLVVQ和ALVLL，表明醬油的發(fā)酵原料及工藝流程對(duì)呈味肽的種類也具有一定的影響。

在這些鑒定出的呈味肽中，部分已經(jīng)被報(bào)道具有較好的呈味效果，如Glu-Glu具有顯著的鮮味，口感豐富；而Glu-Phe稍有澀味，口感豐富[24-25]；QLLN、LLVVQ、ESAY、AELY、FLET、FLTW、ALVLL和QVELF為首次在醬油中鑒定出來(lái)。因此，需要定向合成這些從醬油出鑒定出來(lái)的呈味肽，對(duì)其進(jìn)行基本感官呈味分析和描述性評(píng)價(jià)系列實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證這些呈味肽的呈味效果及其鮮味增強(qiáng)作用、食鹽的增強(qiáng)效應(yīng)、醬油的增效作用。

表3 調(diào)控pH值發(fā)酵的醬油中呈味肽的氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of peptides in soy sauce fermented with pH adjustment

表4 自然pH值發(fā)酵的醬油中呈味肽的氨基酸序列Table 4 Amino acid sequences of peptides in soy sauce fermented without pH adjustment

2.3 呈味肽的呈味閾值及其特性

從表5可知，調(diào)控醬醪pH值發(fā)酵的醬油中獲得的大部分呈味肽呈酸、鮮味，這是由于實(shí)驗(yàn)采用陰離子交換基團(tuán)SPE柱對(duì)醬油中的酸性組分進(jìn)行提取，僅小部分呈綿長(zhǎng)的苦厚味。含有谷氨酸、谷氨酰胺殘基的多肽中，大部分具有較低的呈味閾值，如ED、EE、EF、ESAY、AELY、FLET閾值為500 mg/L，除FLET外，均表現(xiàn)出明顯的鮮味和酸味，口感豐富，ESAY還有利于濃厚感的延長(zhǎng)；EM、EDD、QLLN、LLVVQ的閾值較高，為1 000 mg/L，除LLVVQ具有苦厚味外，均表現(xiàn)出較明顯的鮮味；QNM的閾值最高，為2 000 mg/L，帶有酸澀味。此外，含有纈氨酸殘基的多肽，如SV、LLVVQ、ALVLL，均具有較突出的厚味。LLVVQ、FLET、FLTW、ALVLL中含有較多的苦味氨基酸殘基，因而表現(xiàn)出較明顯的苦味。

表5 合成呈味肽的呈味閾值及特性Table 5 Flavor threshold values and characteristics of synthetic peptides from soy sauces fermented with and without pH adjustment

自然醬醪pH值發(fā)酵的醬油中合成多肽的呈味閾值和特性見(jiàn)表5，其中ED、EE、EDD、SV、EF、LLVVQ、FLET、ALVLL已在調(diào)控pH值醬油中鑒定出，這表明不同發(fā)酵工藝對(duì)醬油成品中呈味肽的組成和含量具有一定的影響。其中NVP、LDP、LL、QVELF和QVELF均包含脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等苦味氨基酸的殘基，因而表現(xiàn)出較為明顯的苦味。

結(jié)果表明，自然pH值醬油發(fā)酵過(guò)程中，pH值不斷降低，谷氨酰胺酶、蛋白酶等活性不斷降低，谷氨酰胺在非酶作用下主要轉(zhuǎn)化為無(wú)味或微酸的焦谷氨酸，從而導(dǎo)致醬油中的呈味肽均呈現(xiàn)較為明顯的苦味。調(diào)控pH值醬油在發(fā)酵過(guò)程中，谷氨酰胺酶及中性蛋白酶活力較高，蛋白質(zhì)被主要分解成小分子肽，如谷氨酰肽等，從而使醬油鮮味有所改善。

2.4 呈味肽對(duì)醬油的呈味影響

依據(jù)表3、4，選擇離子響應(yīng)強(qiáng)度較大的呈味肽，以0.03 g/100 mL添加至醬油中，分析其對(duì)醬油滋味的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可見(jiàn)，添加的ESAY使醬油厚味顯著提高，風(fēng)味得到明顯改善；QLLN的增鮮效果顯著；LLVVQ、AELY、FLET均對(duì)醬油鮮味稍有增強(qiáng)；FLTW、ALVLL的添加未對(duì)醬油產(chǎn)生明顯感官變化。SV的添加使醬油濃厚感突出，風(fēng)味顯著提高；QVELF、ALVLL對(duì)醬油的感官效果無(wú)明顯影響。

表6 醬油合成呈味肽與醬油的呈味效果Table 6 Effects of adding synthetic flavor peptides on the taste of soy sauces fermented with and without pH adjustment

本實(shí)驗(yàn)從兩種不同釀造工藝的醬油中分離鑒定出多種小分子肽，主要為二肽、三肽、四肽等，呈味肽的呈味效果與分子質(zhì)量以及其含有的氨基酸殘基種類有關(guān)。Rhyu等[26]對(duì)大豆提取液中的小分子肽進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為500～1 000 Da的酸性肽具有最強(qiáng)的鮮味，且結(jié)合型谷氨酸和天冬氨酸為鮮味的主要來(lái)源。Zhang Jianan等[27]對(duì)花生分離蛋白水解物進(jìn)行分離鑒定，得到6 種新的呈味肽DQR、NNP、EGF、EDG、TESSSE，其中RGENESEEEGAIVT是第1個(gè)發(fā)現(xiàn)的具有鮮味及鮮味增強(qiáng)能力的十四肽。趙陽(yáng)等[28]從紫貽貝蛋白酶解液中分離純化出的六肽CSVQDQ或QAVNFT，具有明顯的鮮味。Glu、Gln、Asp、Asn之間相互結(jié)合形成的多肽或它們與其他氨基酸形成的多肽，通常具有鮮味或厚味，F(xiàn)eng Tao等[29]從雙孢蘑菇中分離出濃厚感肽GLPD和GHGD，具有顯著的厚味。Liu Jianbin等[30]從酵母抽提物中鑒定出濃厚感肽EV，添加到雞湯中，能夠協(xié)調(diào)各種味覺(jué)。在本實(shí)驗(yàn)鑒定出的呈味肽中，ED、EE、EF、ESAY、AELY、FLET呈現(xiàn)出突出的鮮味，而EM、EDD、QLLN有較強(qiáng)的鮮味。含有Val殘基的多通常具有顯著的濃厚感，本實(shí)驗(yàn)鑒定出的SV、LLVVQ、ALVLL具有較強(qiáng)的厚味，其中SV厚味閾值最低。

3 結(jié) 論

Oasis MAX混合型陰離子SPE柱對(duì)富集醬油中含谷氨酸或天冬氨酸的呈味肽有較好的效果。

從調(diào)控pH值發(fā)酵的醬油中鑒定出14 種呈味肽，從自然pH值發(fā)酵的醬油中鑒定出12 種呈味肽，其中8 種呈味肽（ED、EE、EDD、SV、EF、LLVVQ、FLET、ALVLL）在兩種醬油中均鑒定出。QLLN、LLVVQ、ESAY、AELY、FLET、FLTW、ALVLL和QVELF首次在醬油中鑒定出。

調(diào)控pH值發(fā)酵的醬油中ED、EE、EF、ESAY、AELY、FLET閾值最低，為500 mg/L，除FLET外，其他均表現(xiàn)出明顯的鮮味和酸味，口感豐富，ESAY還有利于厚味的延長(zhǎng)；SV厚味閾值最低，為500 mg/L。自然pH值發(fā)酵的醬油中，SV、LLVVQ、ALVLL具有突出厚味；LLVVQ、FLET、FLTW、ALVLL含有較多的苦味氨基酸殘基，因而表現(xiàn)出較明顯的苦味。

定向合成QLLN、LLVVQ、ESAY、AELY、FLET、FLTW、ALVLL、QVELF、SV，并以0.03 g/100 mL添加到市售醬油中，發(fā)現(xiàn)ESAY顯著降低醬油咸味，提高醬油厚味；QLLN增鮮效果顯著；LLVVQ、AELY、FLET增鮮效果較為顯著；SV的添加使醬油濃厚感突出，風(fēng)味顯著提高。結(jié)果表明，調(diào)控pH值發(fā)酵的醬油中含有較多良好呈味效果的小分子肽，使醬油具有更突出的鮮味和厚味，豐富協(xié)調(diào)醬油的口感。