四大產(chǎn)區(qū)莼菜黃酮類物質(zhì)組成分析及抗氧化、抑菌活性研究

韓芳，李京凌，袁婧，于杰,2*

1(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)2(南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶，400715)

莼菜(Braseniaschreberi)為莼菜科(Cabombaceae)多年生水生蔬菜，野生種已瀕危[1-2]。原廣泛分布于北半球，現(xiàn)主要分布在亞熱帶等地區(qū)[3]。莼菜具有較高的經(jīng)濟價值與保健功能，在我國逐漸形成重慶石柱、湖北利川、四川雷波和杭州西湖四大產(chǎn)區(qū)[4]。莼菜以被覆透明膠質(zhì)且?guī)矍o的葉為其產(chǎn)品部分，富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)等多種活性成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤、降血糖等功效，被譽為“水中人參”“植物胎盤”，為中國傳統(tǒng)藥食兼用植物[5-7]。

黃酮類化合物是以C6-C3-C6為基本骨架的植物次生代謝產(chǎn)物，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為黃酮類、花青素類、異黃酮類、黃烷-3-醇類、黃酮醇類、二氫黃酮類等[8]，因其在抗氧化、降低血管脆性、降血脂等方面功效顯著，研究前景廣闊，現(xiàn)已成為藥用、食用等植物研究上不可忽視的研究內(nèi)容[9]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對莼菜的研究主要集中在栽培管理[10-12]、食用等方面[5-6,13]，對莼菜黃酮類物質(zhì)的研究甚少，國外研究者對莼菜研究發(fā)現(xiàn)其含有抗氧化性很強的槲皮素等黃酮類物質(zhì)[14-16]，但目前尚未有關(guān)于莼菜黃酮類物質(zhì)組成及活性研究方面較為系統(tǒng)的文獻(xiàn)報道，對我國莼菜黃酮類物質(zhì)的基礎(chǔ)研究則更少。

本研究首先對莼菜體外膠質(zhì)、脫膠莼菜葉和未脫膠莼菜葉3個處理部分的總黃酮含量進(jìn)行了測定，因當(dāng)前主要的堿液脫膠方法對莼菜活性物質(zhì)具有一定的破壞作用，本研究選取中國四大產(chǎn)區(qū)莼菜未脫膠葉為試驗材料，甲醇為提取劑，系統(tǒng)研究各產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮、黃酮類物質(zhì)的組成及含量、體外抗氧化活性及抑菌活性，最后利用相關(guān)性分析探究黃酮類物質(zhì)組成及含量在抗氧化、抑菌過程中的作用，旨在為莼菜黃酮類物質(zhì)的進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為采自湖北利川(LC)、四川雷波(LB)、重慶石柱(SZ)和浙江西湖(XH)四大產(chǎn)區(qū)的莼菜(2018年7月末)。選取大小適中、被覆透明膠質(zhì)、無病害帶嫩莖的莼菜葉，清水沖洗3遍后，手工分離體外膠質(zhì)與莼菜葉，各部分經(jīng)冷凍干燥后粉碎過40目篩，粉末保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

Trolox(純度97%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)(純度99%)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine，TPTZ)(純度99%)、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azinobis-(3-etylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)(純度99%)；12種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁(純度98%)、牡荊素(純度99%)、紅草苷(純度98%)、二氫楊梅素(純度98%)、楊梅素(99%)、圣草酚(純度98%)、槲皮素(純度98%)、木犀草素(純度98%)、山奈酚(純度98%)、芹菜素(純度98%)、香橙素(純度98%)、異鼠李素(純度98%)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；800Y型多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；WT2003CH型電子天平，常州萬泰天平儀器有限公司；UV1700型紫外可見光分光光度計，上海重逢科學(xué)儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀(配有2998PDA 二極管陣列檢測器)，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 莼菜提取物制備

稱取各產(chǎn)區(qū)莼菜粉末1.0 g，置于100 mL三角瓶內(nèi)，體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇為提取劑，參考許瑞波等[17]對同為水生植物睡蓮葉黃酮的提取方法，濾液經(jīng)真空減壓濃縮至膏狀，用體積分?jǐn)?shù)50%的二甲基亞砜溶液溶解并定容至25 mL進(jìn)行測定，剩余部分保存于-20 ℃下。

1.3.2 總黃酮含量測定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照GOMEZ等[18]的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。取莼菜提取液0.1 mL，加入純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2分別為2和0.1 mL，混勻靜置6 min后，加入0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的AlCl3溶液反應(yīng)5 min，再加入純水0.6 mL于波長420 nm處測其吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

1.3.3 莼菜黃酮類物質(zhì)的HPLC測定

參照左龍亞[19]的方法略加修改。色譜條件：色譜柱Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，波長320 nm下檢測圣草酚、木犀草素、山奈酚、芹菜素、槲皮素5種黃酮類物質(zhì)的含量，350 nm下檢測紅草苷含量，360 nm下檢測異鼠李素含量；體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B。

1.3.4 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率測定參照GORINSTEIN等[20]的方法略加修改。取莼菜提取液50 μL，加入3.0 mL DPPH反應(yīng)液避光反應(yīng)30 min，于波長 510 nm處測其吸光度值，DPPH自由基清除率按公式(1)計算:

(1)

式中：A0,空白對照吸光度值；A1,樣品溶液吸光度。

ABTS自由基清除率的測定參照ALMEIDA等[21]的方法略加修改。取莼菜提取液25 μL，加入ABTS反應(yīng)液5.0 mL，混勻室溫反應(yīng)10 min,于波長400 nm處測吸光度值，ABTS自由基清除率按公式(2)計算:

(2)

式中：A0，空白對照吸光度值；A1，樣品溶液吸光度。

鐵還原/抗氧化能力(ferric reducing/ antioxidant power，F(xiàn)RAP)值的測定參照BENZIE等[22]的方法，取莼菜提取液50 μL，加入FRAP反應(yīng)液5.0 mL混勻，室溫反應(yīng)10 min，于波長593 nm處測吸光度值，以Trolox做標(biāo)曲線計算FRAP值。

抗氧化能力指數(shù)(APC)按公式(3)計算：

抗氧化能力指數(shù)APC/%=(測定值/最大值)×100

(3)

1.3.5 抑菌活性測定

參照呂爽等[23]的濾紙片法測定莼菜黃酮對變形桿菌(Proteusvulgaris)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的抑菌活性。在無菌操作臺取0.1 mL菌懸液于已倒好的平板上，涂布均勻，將6 mm濾紙片貼在固體培養(yǎng)基上，取10 μL莼菜提取液于濾紙片上，將其置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，測抑菌圈直徑，體積分?jǐn)?shù)50%的二甲基亞砜為陰性對照。抑菌能力指數(shù)計算方法同抗氧化能力指數(shù)。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗均為3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Excel 2016及Origin 9.0作圖。采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素差異顯著性分析和皮爾森相關(guān)性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異是極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 莼菜不同處理及各產(chǎn)區(qū)總黃酮含量比較

2.1.1 莼菜不同處理總黃酮含量比較

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.857 7x-0.033 1，(R2=0.999 6)，在0～2 mg/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線對莼菜總黃酮含量進(jìn)行定量分析。

由圖1可知，莼菜3個處理總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其大小順序為：脫膠莼菜[(47.975±3.481) mg/g]>未脫膠莼菜[(42.213±1.383) mg/g]>體外膠質(zhì)[(6.189±0.603) mg/g]，體外膠質(zhì)總黃酮含量與孫雨欣等[24]對莼菜體外膠質(zhì)總黃酮(5.1 mg/g)的測定結(jié)果相差甚小，其差異可能主要由脫膠方式不同所致。同時本試驗結(jié)果也說明莼菜所含黃酮類物質(zhì)不像多糖一樣主要存在于體外膠質(zhì)[4]，而是主要存在于莼菜葉中。

圖1 莼菜不同處理總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids content in different treatment parts of water shield 注：組間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量比較

由圖2可知，四大產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物中總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其含量為(15.845±0.119)～(42.505±0.458) mg/g，其中，石柱莼菜總黃酮含量最高，利川[(39.325±0.681) mg/g]和雷波[(24.243±0.700) mg/g]次之，西湖最低。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids content of water shield in different production areas

2.2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物黃酮類物質(zhì)組成

黃酮類物質(zhì)泛指擁有15個碳原子的酚類化合物，主要存在于植物的葉、果皮和果實等部位[25]，其種類和含量因植物種類、生長環(huán)境及成熟度等而異。研究表明，莼菜耐儲性較差，其活性物質(zhì)會隨貯存時間的延長而散失，且隨存儲條件的不同散失程度也不同[26]。LEGAULT等[14]、LEE等[15]研究，發(fā)現(xiàn)莼菜中含有抗氧化作用較強的槲皮素。SHIMODA等[16]以6月份采自日本的莼菜葉為材料，利用質(zhì)譜檢測確定酚類物質(zhì)種類及結(jié)構(gòu)，共鑒定出5種黃酮類化合物(槲皮素、山奈酚、棉花素、hypolaetin 7-O-glucoside、junsainoside A)和多種酚酸類物質(zhì)。本試驗利用12種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(圖3)，通過高效液相色譜法從莼菜甲醇提取物中共檢測到7種黃酮類物質(zhì)(圖4、圖5)，木犀草素、異鼠李素、紅草苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚和圣草酚，且黃酮類物質(zhì)種類及含量在不同產(chǎn)區(qū)莼菜提取物中存在顯著差異(P<0.05)。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果存在較大差異，可能主要與所選材料生長環(huán)境及莼菜成熟度不同有關(guān)，也有可能與所采用的檢測方法等不同有關(guān)。

1-二氫楊梅素；2-香橙素；3-楊梅素；4-圣草酚；5-槲皮素；6-木犀草素； 7-山奈酚；8-芹菜素；9-紅草苷；10-牡荊素；11-蘆?。?2-異鼠李素 a-320 nm 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；b-350 nm標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖； c-360 nm標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖3 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Chromatogram of the standard

試驗測得黃酮類物質(zhì)主要由異鼠李素、槲皮素和山奈酚組成, 含量分別為(37.630±0.797)～(367.534±3.822) mg/kg、(8.931±0.029)～(240.596±1.263) mg/kg和(4.089±0.021)～(48.291±0.687) mg/kg。同為水生植物的荷葉黃酮主要為異鼠李素、槲皮素[27]，王蓮葉主要黃酮類物質(zhì)為槲皮素、山奈酚[28]，與本研究結(jié)果類似。木犀草素的含量為(0.840±0.077)～(4.670±0.045) mg/kg，在西湖莼菜提取物中含量最低，石柱莼菜含量最高。紅草苷僅少量存在于利川、雷波和石柱莼菜提取物中，西湖莼菜提取物未檢測到該物質(zhì)。圣草酚僅少量存在于雷波和石柱莼菜提取物中，含量分別為(7.543±0.225)和(17.311±0.589) mg/kg?？傮w來看，石柱莼菜在黃酮類物質(zhì)組成及含量上均高于其他3個產(chǎn)區(qū)，西湖莼菜黃酮組成及含量在4個產(chǎn)區(qū)中最低。

a-320 nm部分樣品色譜圖；b-350 nm部分樣品色譜圖； c-360 nm部分樣品色譜圖 1-圣草酚；2-槲皮素；3-木犀草素；4-山奈酚； 5-芹菜素；6-紅草苷；7-異鼠李素圖4 部分黃酮類物質(zhì)色譜圖Fig.4 Chromatogram of flavonoids

圖5 各產(chǎn)區(qū)莼菜黃酮物質(zhì)種類及含量Fig.5 Types and contents of flavonoids in water shield from different producing areas

2.3 抗氧化結(jié)果

2.3.1 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抗氧化活性比較

由圖6可知，各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物對兩類自由基清除率及還原值均具有顯著性差異(P<0.05)。DPPH自由基清除率為(21.188±0.953)%～(88.409±0.810)%，除西湖莼菜外，清除率均顯著高于抗壞血酸陽性對照組(55.227±0.821)%。ABTS自由基清除率為(25.461±1.123)%～(96.245±1.141)%，除西湖莼菜外，其他產(chǎn)區(qū)莼菜提取物ABTS自由基清除率也顯著高于抗壞血酸陽性對照組(51.794±0.575)%。FRAP還原值為(26.455±2.554)～(151.968±1.885)μmol/g，除西湖莼菜外，其他各產(chǎn)區(qū)FRAP還原值與自由基清除率類似，均顯著高于抗壞血酸陽性對照組(53.795±0.419)μmol/g。

整體來看，ABTS自由基清除率高于DPPH自由基清除率，但3種抗氧化法對不同產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮抗氧化能力的評價大小變化順序一致，均為：石柱莼菜﹥利川莼菜﹥雷波莼菜﹥西湖莼菜。

a-自由基清除率;b-鐵離子還原值圖6 不同產(chǎn)區(qū)莼菜抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of water shield from different producing areas

2.3.2 四大產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抗氧化活性綜合評價

由抗氧化結(jié)果所得的APC指數(shù)均值(%)及排序(表1)表明，各產(chǎn)區(qū)莼菜均具有抗氧化活性，但各產(chǎn)地莼菜抗氧化指數(shù)均值變化幅度較大，在21.73%～100%。其中，石柱莼菜甲醇提取物的抗氧化指數(shù)均值最大，為100%，利川(83.57%)和雷波(78.46%)次之，西湖莼菜最小，為21.73%，與各產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量大小順序一致。

表1 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抗氧化活性APC指數(shù)及排序Table 1 APC index and ranking of antioxidant activities of methanol extracts from water shield indifferent producing areas

2.4 抑菌結(jié)果

2.4.1 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抑菌活性比較

本研究發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)莼菜提取物對3種人體致病菌均具有顯著抑制作用(圖7、表2)，抑菌圈直徑在(8.527±0.564)～(15.660±0.803) mm，這一結(jié)果與袁麗萍等[29]對荷葉黃酮的抑菌報道類似。但莼菜黃酮對3種細(xì)菌的抑制程度不同，總體來看對變形桿菌和大腸桿菌的抑菌效果要強于銅綠假單胞菌。依據(jù)董蘭芳等[30]的抑菌圈試驗判定標(biāo)準(zhǔn)，3種細(xì)菌對各產(chǎn)區(qū)莼菜提取物均表現(xiàn)為中度敏感。

圖7 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物對細(xì)菌生長的影響Fig.7 Effect of methanol extract of water shield from different producing areas on bacterial growth

表2 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of methanol extract from water shield in different producing areas

2.4.2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物綜合抑菌活性比較

由表3可知，各產(chǎn)區(qū)莼菜均具有抑菌活性，且各產(chǎn)地莼菜抑菌活性APC指數(shù)均值變化幅度較小(73.55%～100%)。其中，石柱莼菜甲醇提取物的抑菌活性APC指數(shù)均值最大，為100%，利川(85.92%)和雷波(82.13%)次之，西湖莼菜最小(73.55%)。通過APC指數(shù)均值排序發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地莼菜抑菌能力大小順序為：石柱﹥利川﹥雷波﹥西湖，與各產(chǎn)地莼菜總黃酮含量及抗氧化順序一致。

表3 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抑菌活性APC指數(shù)及排序Table 3 APC index and ranking of antibacterial activity of methanol extract from water shield in different producing areas

2.5 莼菜黃酮類物質(zhì)與抗氧化、抑菌活性的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表4)，莼菜總黃酮及測定的7

表4 黃酮類物質(zhì)與抗氧化、抑菌活性的相關(guān)性Table 4 Correlation between flavonoids and antioxidant and bacteriostatic activities

種黃酮類物質(zhì)單體均具有不同程度的抗氧化、抑菌作用，且總黃酮含量與紅草苷及異鼠李素分別存在極顯著和顯著正相關(guān)性，對應(yīng)系數(shù)分別為0.990和0.976。抗氧化相關(guān)性分析顯示，總黃酮物質(zhì)含量與DPPH、ABTS和FRAP三種體外抗氧化評價法的結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.814～0.919，表明總黃酮物質(zhì)含量在抗氧化過程中起重要作用。抑菌相關(guān)性分析顯示，槲皮素、木犀草素和山奈酚對變形桿菌具有極顯著或顯著抑制作用，相關(guān)系數(shù)為0.989～0.998，總黃酮和異鼠李素對大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有顯著或極顯著抑制作用，相關(guān)系數(shù)在0.966～0.998之間，表明這5類物質(zhì)在抑菌過程中有重要貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

莼菜中黃酮類物質(zhì)主要存在于莼菜葉中，且四大產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量存在顯著的地區(qū)差異，其大小順序為：石柱莼菜﹥利川莼菜﹥雷波莼菜﹥西湖莼菜。本試驗在莼菜中共測定了7種黃酮類物質(zhì)，分別為異鼠李素、槲皮素、山奈酚、木犀草素、葒草苷、芹菜素和圣草酚，其中異鼠李素、槲皮素和山奈酚為本試驗所測主要黃酮成分，且含量及組成均存在地區(qū)差異?？寡趸耙志囼灲Y(jié)果顯示，莼菜抗氧化能力很強，抑菌能力較弱，3種細(xì)菌對各產(chǎn)區(qū)莼菜提取物均表現(xiàn)為中度敏感。相關(guān)性分析結(jié)果表明，莼菜總黃酮含量及檢測到的7種黃酮類物質(zhì)單體均具有抗氧化、抑菌作用。