嗜糖假單胞菌麥芽四糖酶基因在地衣芽孢桿菌中的異源表達

樓志華，劉翔，張勁楠

1(江蘇省奧谷生物科技有限公司，江蘇 常州，213300)2(溧陽維信生物科技有限公司，江蘇 常州，213300)

麥芽四糖酶 (glucan 1,4-α-maltotetraohydrolase)，又名麥芽四糖淀粉水解酶,可以連續(xù)地催化淀粉狀多糖中非還原型末端麥芽四糖殘基的水解，主要產(chǎn)物為麥芽四糖[1]。而麥芽四糖因其獨特的理化特性，一度被譽為最有希望的麥芽低聚糖[2]，在食品加工行業(yè)有著廣泛、重要的應用。

麥芽四糖酶基因主要來源于斯氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)和嗜糖假單胞菌(Pseudomonassaccharophila)，二者來源的麥芽四糖酶均為α構型。相比而言，嗜糖假單胞菌來源的麥芽四糖酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均較好，在40 ℃以下和pH 5.5～11均能長時間保持穩(wěn)定；在最適溫度(55 ℃)、最適pH(6.7)以及在其他宿主內表達后酶活力也均較高[3]。這些因素表明嗜糖假單胞菌來源的麥芽四糖酶更適合于工業(yè)化應用，也因而備受學者的關注。國內，ZHOU、趙云等[4-5]在大腸桿菌中克隆表達了嗜糖假單胞菌來源的麥芽四糖酶，但獲得的重組酶大部分是包涵體，重組酶活力并不高。2019年，張梓芊、楊亞楠等[6-7]在Bacillussubtilis中構建了表達系統(tǒng)胞外表達了嗜糖假單胞菌來源的麥芽四糖酶，發(fā)現(xiàn)其比活力為980.49 U/mg，通過發(fā)酵優(yōu)化后，在搖瓶水平重組酶活力可高達147 U/mL。這些報道中，重組酶酶學性質基本一致，在芽孢桿菌中表達可獲得更高的活力。國外，美國杰能科公司上市的麥芽四糖酶SAS3則以地衣芽孢桿菌為宿主進行重組表達[8]，并且在地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)相關淀粉酶方面形成了技術封鎖，因此導致國內純化的麥芽四糖價格極高。地衣芽孢桿菌是優(yōu)良的食品安全級表達宿主，被美國FDA認定為食品安全級菌株(Generally Recognized As Safe, GRAS)已有近40年的歷史，而且該菌產(chǎn)酶能力高，胞外蛋白分泌能力大約是枯草芽孢桿菌的2倍[9]。然而，國內目前還未發(fā)現(xiàn)有關重組地衣芽孢桿菌表達麥芽四糖酶的研究。

本研究擬構建地衣芽孢桿菌表達系統(tǒng)，對來源于嗜糖假單胞菌的麥芽四糖酶基因進行木糖誘導表達，通過果聚糖合酶信號肽使麥芽四糖酶分泌至胞外，并對構建的重組菌進行初步發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為地衣芽孢桿菌的異源表達以及麥芽四糖酶的工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本研究所用敲除了α-淀粉酶基因amyL和堿性蛋白酶基因aprE的地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisCICIM B1391(BLΔAE)、E.coliJM109以及大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質粒pHY300-PLK，均購于江南大學，由江蘇省奧谷生物科技有限公司保藏。重組質粒pBLSY2由江南大學石貴陽教授惠贈，該重組質粒攜帶了來源于B.licheniformisCICIM B1391自身的木糖異構酶啟動子及其調控蛋白基因、枯草芽孢桿菌果聚糖合酶信號肽基因sacBss、B.licheniformisATCC 14580的麥芽糖淀粉酶基因以及木糖異構酶基因的終止子ter。嗜糖假單胞菌麥芽四糖酶基因序列由NCBI數(shù)據(jù)庫查尋獲得，序列號為：X16732.1，將該序列和終止子ter一并委托上海生物工程有限公司合成，合成后的片段插入至質粒pET28a中，即pET28a-G4-ter。重組質粒pBLxys、pBLG4，重組地衣芽孢桿菌BLG4由本研究構建。

1.2 工具酶、引物和試劑

含DNA聚合酶的Taq和Pfu預混液、T4 DNA連接酶，Thermo Fisher公司；各種限制性內切酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質粒提取試劑盒,TAKARA有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1；酵母粉和蛋白胨,安琪酵母有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 DNA操作技術

質粒提取、DNA片段純化、回收等均參照TAKARA試劑盒說明書。PCR擴增反應、DNA瓊脂糖凝膠電泳、酶切、連接以及轉化子篩選等均參照分子克隆實驗指南[10]。

1.4 木糖誘導分泌表達載體的構建

首先以重組質粒pBLSY2為模板，以PxylF、PxylsR為引物，擴增含木糖異構酶啟動子及其調控蛋白基因和信號肽的基因片段Blxyl-sacBss，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。然后分別同pHY300-PLK經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切后通過膠回收克隆至pHY300-PLK，獲得木糖誘導分泌表達的重組質粒pBLxys后轉化至E.coliJM109，即E.coliJM109/pBLxys。再以pET28a-G4-ter為模板，以引物PxylsF、PterR擴增麥芽四糖酶結構基因，反應條件與上述一致，再分別同pHY300-PLK經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ酶切后通過膠回收克隆至pBLxys，即為木糖誘導分泌表達麥芽四糖酶的重組質粒pBLG4，經(jīng)過轉化子篩選后，送去測序，測序正確后即獲得攜帶pBLG4重組質粒的E.coliJM109/pBLG4。

1.5 重組地衣芽孢桿菌的構建

培養(yǎng)E.coliJM109/pBLxys、E.coliJM109/pBLG4，提取重組質粒pBLxys、pBLG4后，按文獻[13]所述電轉方法分別將其轉入BLΔAE，從而獲得重組地衣芽孢桿菌BLXYLS和BLG4。

1.6 麥芽四糖酶酶活定義及測定

麥芽四糖酶酶活力單位(U)定義為：在pH 7.0和50 ℃的反應條件下，每分鐘分解可溶性淀粉生成相當于1 μmoL葡萄糖所需的酶量。

麥芽四糖酶酶活測定方法參照文獻[5]。

1.7 發(fā)酵優(yōu)化實驗

LBG培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨FP321 10.0，酵母粉FM408 5.0，NaCl 10.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麥芽糊精 90，蛋白胨FP321 20，酵母粉FM408 10，玉米漿干粉5，(NH4)2HPO410，K2HPO4·3H2O 9.12，KH2PO41.36，CaCl20.50，MgSO4·7H2O 0.50。

在進行發(fā)酵優(yōu)化實驗時，均使用擋板搖瓶進行發(fā)酵，發(fā)酵前均加入終質量濃度為20 mg/L的四環(huán)素。每組實驗做3個平行。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建

根據(jù)NCBI顯示，嗜糖假單胞菌麥芽四糖酶基因序列(G4-ter)總長約1.7 kbp，編碼551個氨基酸，理論上蛋白大小為59.9 kDa，而終止子序列總長為0.1 kbp，因此KpnⅠ和XbaⅠ酶切后應獲得約1.8 kbp和6.3 kbp大小的2條核酸條帶。Blxyl-sacBss基因片段長度約為1.4 kbp，經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切后應獲得約6.7 kbp和1.4 kbp大小的2條核酸條帶。對獲得的克隆宿主E.coliJM109/ pBLG4提取重組質粒pBLG4，質粒大小約8.1 kbp，構建重組表達載體圖見圖1。然后分別用HindⅢ、HindⅢ和KpnⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ酶切，電泳鑒定結果如圖2，結合測序結果，可以充分說明重組表達載體構建正確。

2.2 重組麥芽四糖酶的表達

將對照菌BLXYLS和重組菌BLG4分別進行搖瓶發(fā)酵，接種后8 h均加入10 g/L木糖進行誘導，然后繼續(xù)培養(yǎng)30 h，離心后收集發(fā)酵液上清，分別檢測二者胞外麥芽四糖酶活力。結果顯示，只有重組菌BLG4檢測到活力，而對照菌BLXYLS未檢測到活力。將二者發(fā)酵液上清進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析，結果見圖3。可以發(fā)現(xiàn)在約60 kDa處出現(xiàn)一明顯的表達條帶，這與理論推測的蛋白大小基本一致，表明重組菌成功地將麥芽四糖酶分泌到了發(fā)酵液中。

Blxyl-木糖異構酶啟動子及其調控蛋白基因；sacBss-枯草 芽孢桿菌果聚糖合酶信號肽基因；G4-嗜糖假單胞菌 麥芽四糖酶基因；ter-木糖異構酶基因的終止子圖1 重組表達載體pBLG4Fig.1 Diagram of recombinant expression vector pBLG4

M-Maker；1-pBLG4/Hind Ⅲ；2-pBLG4/Hind Ⅲ+ Kpn Ⅰ； 3-pBLG4/Kpn Ⅰ+ Xba Ⅰ圖2 重組表達載體pBLG4驗證電泳圖Fig.2 Electropherogram of recombinant expression vector pBLG4

M-Maker；1-BLXYLS；2-BLG4圖3 發(fā)酵液上清液SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electropherogram of fermentation broth supernatant

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 誘導劑添加時間對發(fā)酵的影響

重組菌接種后，在37 ℃、250 r/min下進行培養(yǎng)，分別在接種后的8、12、16、20、24、28、32 h取樣檢測OD600，并添加10 g/L木糖進行誘導，發(fā)酵至24 h時補加30 g/L麥芽糊精，發(fā)酵至48 h時添加10 g/L的木糖，然后繼續(xù)發(fā)酵至72 h結束。發(fā)酵結束后，取樣檢測OD600和發(fā)酵液中的麥芽四糖酶活力，結果如表2、圖4所示。結果顯示，誘導劑添加時間對重組菌生長影響較小，但對發(fā)酵結束時胞外麥芽四糖酶酶活有顯著影響。隨著誘導劑添加時間的延遲(8～24 h)，發(fā)酵結束時檢測到的胞外酶活呈遞增趨勢，當發(fā)酵24 h添加誘導劑時，發(fā)酵結束時胞外酶活力高達(138.2±11.2) U/mL；而當28、32 h添加誘導劑時，發(fā)酵結束時酶活有所降低。

事實上，這與木糖操縱子在地衣芽孢桿菌中的轉錄特性有關，據(jù)文獻[12-13]報道，在對數(shù)生長期到穩(wěn)定期的轉換期間木糖操縱子轉錄活性顯著增加，并且這種較高的轉錄活性會維持近12 h。根據(jù)檢測到的菌體量來看，發(fā)酵至24 h后，重組菌的生長速率明顯降低，該時間點對應文獻中對數(shù)生長期到穩(wěn)定期的轉換期間，因此，在發(fā)酵24 h時誘導能夠檢測到較高的麥芽四糖酶酶活。

2.3.2 誘導溫度對發(fā)酵的影響

重組菌接種后，在37 ℃、250 r/min下進行培養(yǎng)，當培養(yǎng)至24 h時，添加10 g/L木糖進行誘導，并添加30 g/L麥芽糊精，分別轉移至25、30、37、42 ℃，發(fā)酵至48 h時添加10 g/L的木糖和30 g/L，然后繼續(xù)發(fā)酵至72 h結束。發(fā)酵結束后，取樣檢測OD600和發(fā)酵液中的麥芽四糖酶活力，結果如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，誘導溫度對重組菌生長和產(chǎn)酶均有顯著的影響。在25～37 ℃，隨著溫度升高，發(fā)酵結束后的菌體量也越來越高，而42 ℃時，菌體量又有所降低，這說明重組菌最適生長溫度為37 ℃。當誘導溫度為30 ℃時，胞外酶活力最高可達(161.4±10.4) U/mL，37 ℃次之，42 ℃時胞外酶活力最低。

重組菌在溫度脅迫下的產(chǎn)酶特性是可以預見的。溫度低時，菌體整體代謝速率較慢，酶的合成速率也會降低[14]。而溫度較高時，盡管菌體代謝速率增加，但地衣芽孢桿菌分泌的其他蛋白酶也會增加[15]，對重組酶的水解速率也會增加，另外重組酶自身的穩(wěn)定性也可能有所下降。所以，誘導溫度變化對重組菌生長和重組酶酶活力均有較大的影響。

表2 不同時間添加誘導劑發(fā)酵結束時的菌體量Table 2 Biomass at the end of fermentation under different induction time

圖4 誘導劑不同添加時間對重組菌表達麥芽四糖酶的影響Fig.4 Effect of different adding time of inducer on the expression of maltotetraose in recombinant bacteria

圖5 誘導溫度對重組菌表達麥芽四糖酶的影響Fig.5 Effect of induction temperature on the expression of maltotetraose in recombinant bacteria

2.3.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

根據(jù)2.3.1和2.3.2的結果，在37 ℃、250 r/min下對重組菌進行培養(yǎng)，當培養(yǎng)至24 h時，添加2%木糖進行誘導，并轉移至30 ℃繼續(xù)發(fā)酵。誘導后每隔12 h檢測菌體量OD600和麥芽四糖酶酶活。結果如圖6所示?？梢钥吹?，發(fā)酵至84 h時，胞外檢測到的最大酶活力為(168.2±9.41) U/mL，之后酶活力明顯開始下降。顯然，重組地衣芽孢桿菌胞外酶活力開始下降的時間要略晚于穩(wěn)定期，這與2.3.1小節(jié)所記錄的特性相符，表明木糖誘導型重組地衣芽孢桿菌發(fā)酵至穩(wěn)定期結束時停止發(fā)酵最為合適。

圖6 重組地衣芽孢桿菌發(fā)酵過程曲線Fig.6 Growth and maltotetraose production curves of recombinant Bacillus licheniformis

在后續(xù)應用過程中，對重組酶的酶學性質進行了簡單研究。以淀粉液為化液底物反應時，其最適pH為7.0，最適反應溫度為50 ℃，并且在反應48 h后，相對酶活力仍能達50%以上，結合異淀粉酶進行轉化，麥芽四糖轉化率可達72.4%，其特性與文獻報道[5-7]基本一致，表明重組酶的酶學性質未發(fā)生明顯改變，有良好的應用前景。目前，國內對麥芽四糖酶的發(fā)酵還處于基礎研究階段，多見于在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌中的表達，在地衣芽孢桿菌中的表達未見報道。楊亞楠等[7]在以枯草芽孢桿菌表達來源于嗜糖假單胞麥芽四糖酶的表達時，搖瓶水平酶活力可力達147 U/mL，本研究搖瓶水平酶活力可達(168.2±9.41) U/mL，較之有所提高，但提高有限。多項研究顯示，地衣芽孢桿菌胞外蛋白分泌量可達枯草芽孢桿菌的2倍[9]，這表明地衣芽孢的表達性能仍未被完全開發(fā)，其優(yōu)勢尚未完全發(fā)揮，可提升的空間仍然很大。據(jù)報道[1]，美國杰能科公司也是通過重組地衣芽孢桿菌分批補料發(fā)酵，表達嗜糖假單胞菌的麥芽四糖酶，根據(jù)該酶的比酶活[7]及地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性，保守估計其發(fā)酵水平應在10 000 U/mL左右。就本研究結果來看，盡管繼續(xù)通過發(fā)酵優(yōu)化能夠繼續(xù)提升發(fā)酵水平，但提升效果可能有限，還需要充分挖掘地衣芽孢桿菌的表達潛力，提升其表達能力，諸如在密碼子偏好性[16]，酶蛋白修飾[17]，蛋白酶基因繼續(xù)敲除[18]，高效啟動子開發(fā)[19-20]等方面均可繼續(xù)進行深入研究。

3 結論

本研究利用地衣芽孢桿菌木糖誘導分泌表達載體，對來源于嗜糖假單胞菌麥芽四糖基因進行了表達，重組酶成功地分泌至胞外，能夠在發(fā)酵液上清液中檢測到酶活力，而且目標蛋白大小符合理論大小。對重組菌進行了發(fā)酵條件優(yōu)化：在24 h添加誘導劑，誘導溫度30 ℃，發(fā)酵至穩(wěn)定期結束停止發(fā)酵，搖瓶水平可高達(168.2±9.41) U/mL。